1. Tuiscint tosaigh

Ag an gcéim seo, ní mór dúinn roinnt coincheapa agus téarmaíocht a thuiscint, ionas nach ndéanfar botúin os comhair ár ndaoine scothaosta, mar shampla:

C: Cad é an difríocht idir RT-PCR, qPCR, PCR Fíor-ama, agus RT-PCR fíor-ama?

Freagra: Is PCR trascríobh droim ar ais é RT-PCR(trascríobh droim ar ais PCR, RT-PCR), a úsáidtear go forleathan imoibriú slabhrúil polaiméaráise (PCR).In RT-PCR, déantar snáithe RNA a thras-scríobh ar ais go DNA comhlántach, a úsáidtear ansin mar theimpléad le haghaidh aimpliú DNA trí PCR.
Fíor-ama-PCR agus qPCR(Cainníochtúil Rea-ltime-PCR) an rud céanna, tá an dá PCR cainníochtúla fíor-ama, rud a chiallaíonn go bhfuil taifid sonraí fíor-ama ag gach timthriall de PCR, agus mar sin is féidir líon na dteimpléad tosaigh a choigeartú anailís bheacht.

Cé gur cosúil go ngiorraítear PCR Fíor-ama (PCR cainníochtúil fluaraiseachta fíor-ama) agus PCR Trascríobh Droim ar ais (PCR trascríobh droim ar ais) mar RT-PCR, is é an coinbhinsiún idirnáisiúnta ná: Tagraíonn RT-PCR go sonrach do thrascríobh droim ar ais.PCR , déantar PCR fíor-ama a ghiorrú go ginearálta mar qPCR (PCR cainníochtúil fíor-ama).

Agus fíor-ama RT-PCR (RT-qPCR), Is é an PCR trascríobh droim ar ais in éineacht leis an teicneolaíocht chainníochtúil fluaraiseacha: faigh cDNA (RT) ar dtús ó thrascríobh droim ar ais RNA, agus ansin bain úsáid as PCR Fíor-ama le haghaidh anailís chainníochtúil (qPCR).Déanann an chuid is mó de na saotharlanna RT-qPCR, is é sin, taighde ar síos-rialáil abairt RNA, mar sin tagraíonn an qPCR a labhraíonn gach duine sa tsaotharlann do RT-qPCR i ndáiríre, ach ná déan dearmad go bhfuil go leor tástálacha DNA fós in iarratais chliniciúla.Anailís chainníochtúil, mar shampla víreas heipitíteas B a bhrath HBV.

Ceist: Tar éis go leor PCR cainníochtúla fluaraiseacha a léamh, cén fáth ar chóir an blúire aimplithe a rialú laistigh den raon 80-300bp?

Freagra: Tá fad gach seicheamh géine difriúil, tá cuid acu roinnt kb, tá cuid acu na céadta bp, ach ní mór dúinn ach fad an táirge a cheangal go 80-300bp nuair a bhíonn primers á ndearadh, nach bhfuil ró-ghearr nó ró-fhada oiriúnach le haghaidh braite fluaraiseachta cainníochtúil PCR .Tá blúire an táirge ró-ghearr chun idirdhealú a dhéanamh air ón primer-dimer.Tá fad an primer-dimer thart ar 30-40bp, agus tá sé deacair idirdhealú a dhéanamh an bhfuil sé primer-dimer nó táirge má tá sé níos lú ná 80bp.Má tá an blúire táirge ró-fhada, níos mó ná 300bp, beidh sé mar thoradh go héasca ar éifeachtacht aimplithe íseal agus ní féidir leis an méid géine a bhrath go héifeachtach.

Mar shampla, nuair a chomhaireamh tú cé mhéad duine atá sa seomra ranga, ní gá duit ach a chomhaireamh cé mhéad béal atá ann.Tá an rud céanna fíor nuair a bhraitheann tú géinte, ní gá duit ach seicheamh áirithe géine a bhrath chun ionadaíocht a dhéanamh Déanfaidh an t-ord iomlán.Más mian leat daoine a chomhaireamh, ní mór duit an dá bhéal agus na srón, na cluasa agus na spéaclaí a chomhaireamh, agus tá sé éasca botúin a dhéanamh.

Le leathnú, i dtaighde bitheolaíoch, tá go leor cásanna taighde ó phointe go ceantar, toisc go bhfuil seicheamh géine aon speiceas an-fhada, tá sé gan ghá agus dodhéanta gach blúirí a thomhas, mar shampla seicheamhú baictéarach 16S, is é sin seicheamh coimeádach na dTréithe baictéir chun tátal a bhaint as líon daonra áirithe baictéir.

C: Cad é an fad is fearr le haghaidh dearadh primer qPCR?

Freagra: Go ginearálta, tá an fad primer thart ar 20-24bp, atá níos fearr.Ar ndóigh, ní mór dúinn aird a thabhairt ar luach TM an primer agus an primer á dhearadh, toisc go bhfuil baint aige seo leis an teocht annealing is fearr.Tar éis go leor turgnaimh, tá sé cruthaithe gur luach TM níos fearr é 60°C.Má tá an teocht annealing ró-íseal, beidh sé mar thoradh go héasca ar aimpliú neamh-shonrach.Má tá an teocht annealing ró-ard, beidh an éifeachtacht aimpliúcháin sách íseal, tosóidh buaic an chuar aimpliúcháin níos déanaí, agus cuirfear moill ar an luach CT.

C: Cén chaoi a bhfuil an modh ruaime difriúil ón modh probe?

Freagra: Modh líNí astaíonn roinnt ruaimeanna fluaraiseacha, mar shampla SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., solas leo féin, ach scaoilfidh siad fluaraiseacht tar éis iad a cheangal leis an mion-groove de DNA dhá shnáithe.Mar sin, ag tús an imoibrithe PCR, ní féidir leis an meaisín an comhartha fluaraiseacha a bhrath.Nuair a shroicheann an t-imoibriú an chéim síneadh annealing, osclaítear an snáithe dúbailte, agus déantar snáithe nua a shintéisiú faoi ghníomhaíocht DNA polymerase, agus ceanglaíonn an móilín fluaraiseacha leis an mion-groove dsDNA.De réir mar a mhéadaíonn líon na dtimthriallta PCR, déantar ruaimeanna níos mó agus níos mó a chomhcheangal le DNA dúbailte-snáithe, agus feabhsaítear an comhartha fluaraiseacha go leanúnach freisin.Úsáidtear an modh lí go príomha i dtaighde eolaíoch.
PS: Bí cúramach agus an turgnamh á dhéanamh, ní mór an dath a chomhcheangal le DNA daonna, bí cúramach é a iompú ina dhuine fluaraiseacha.

Modh ruaime (ar chlé) Modh taiscéalaithe (ar dheis)
PS: Bí cúramach agus an turgnamh á dhéanamh, ní mór an dath a chomhcheangal le DNA daonna, bí cúramach é a iompú ina dhuine fluaraiseacha.

SYBR Green Ⅰ a cheanglaíonn an groove beag DNA

Modh taiscéalaitheIs é taiscéalaí Taqman an taiscéalaí hidrealaithe is coitianta a úsáidtear.Tá grúpa fluaraiseacha ag deireadh 5′ an taiscéalaíochta, FAM de ghnáth, agus is seicheamh é an taiscéalaí féin a chomhlánaíonn an spriocghéin.Tá grúpa múchadh fluaraiseacha ag an deireadh 3′.De réir phrionsabal an aistrithe fuinnimh athshondais fhluaraiseachta (aistriú fuinnimh athshondais Förster, FRET), nuair a bhíonn an grúpa fluaraiseachta tuairisceora (móilín fluaraiseachta deontóra) agus an grúpa fluaraiseachta múchadh (glacadóir móilín fluaraiseachta) ar bís Nuair a bhíonn forluí ar an speictrim agus an t-achar an-dlúth (7-10nm), is féidir leis an excitation an móilín fluaraiseachta sa mhóilín deontóra, agus an móilín fluaraiseachta sa deontóir a ghlacadh. lagaithe.Dá bhrí sin, ag tús an imoibrithe PCR, nuair a bhíonn an probe saor agus slán sa chóras, ní scaoilfidh an grúpa fluaraiseachta tuairisceoirí fluaraiseacht.Nuair a bhíonn sé á anáil, ceanglaíonn an primer agus an taiscéalaí leis an teimpléad.Le linn na céime síneadh, déanann an polymerase slabhraí nua a shintéisiú go leanúnach.Tá gníomhaíocht exonuclease 5′-3′ ag DNA polymerase.Nuair a shroichfidh sé an taiscéalaí, déanfaidh an DNA polymerase an tóireadóir a hidrealú ón teimpléad, scarfaidh an grúpa fluaraiseachta tuairisceora ón ngrúpa fluaraiseacha quencher, agus scaoilfidh sé an comhartha fluaraiseachta.Ós rud é go bhfuil gaol duine le duine idir an taiscéalaí agus an teimpléad, is fearr an modh taiscéalaithe ná an modh ruaime i dtéarmaí cruinneas agus íogaireacht na tástála.Úsáidtear an modh probe go príomha i diagnóis.

C: Cad is cainníochtú iomlán ann?Cad is Cainníochtú Coibhneasta ann?

Freagra: Tagraíonn cainníochtú iomlán do ríomh uimhir chóip tosaigh an tsampla atá le tástáil ag qPCR, mar shampla cé mhéad víreas HBV atá i 1ml fola.Is é an toradh a fhaightear trí chainníochtú coibhneasta ná an t-athrú ar mhéid na sprice géine i sampla sonrach i gcoibhneas le sampla tagartha eile, agus tá an slonn géine suas-rialaithe nó síos-rialaithe.

C: An ndéanfaidh an méid eastóscadh RNA, éifeachtúlacht trascríobh droim ar ais, agus éifeachtúlacht aimplithe difear do thorthaí turgnamhacha?
C: An ndéanfaidh stóráil shamplach, imoibrithe eastósctha, imoibrithe trascríobh droim ar ais, agus ábhair inchaite tarchurtha solais difear do thorthaí an turgnaimh?
C: Cén modh is féidir na sonraí turgnamhacha a cheartú?

Maidir leis na saincheisteanna seo, cuirfimid síos orthu go mion sna hailt chun cinn agus sna hardchodanna thíos.
2. Ard-eolas

Maidir le PCR cainníochtúla fluaraiseacha fíor-ama, ní mór dúinn an réaltacht a aithint go bhfoilsítear na mílte páipéar taighde eolaíoch gach bliain, ina measc nach bhfuil an teicneolaíocht chainníochtúil fluaraiseachta PCR líon beag.

Mura bhfuil aon chaighdeán coitianta ann chun an turgnamh cainníochtúil PCR fluaraiseachta a thomhas, féadfaidh na torthaí a bheith éagsúil go forleathan.Maidir leis an géine céanna den speiceas céanna, leis an modh próiseála céanna, beidh na torthaí braite éagsúil go forleathan freisin, agus beidh sé deacair do dhaoine déanacha na torthaí céanna a athdhéanamh.Tusa Níl a fhios ag éinne cé acu atá ceart agus cé atá mícheart.

An gciallaíonn sé seo gur teicneolaíocht cheat nó teicneolaíocht neamhiontaofa é PCR cainníochtúil fluaraiseacha?Níl, is é an fáth go bhfuil PCR cainníochtúil fluaraiseacha níos íogaire agus níos cruinne, agus go dtiocfaidh torthaí go hiomlán os coinne le hoibriú beag mícheart.Tá caillteanas beag míle míle ar shiúl.Féadfaidh na hathbhreithneoirí údar an ailt a chéasadh arís agus arís eile.Ag an am céanna, tá sé deacair freisin d'athbhreithneoirí na hirise torthaí turgnamhacha éagsúla a roghnú.

Tríd is tríd, ag tagairt do easpa comhaontaithe i dturgnaimh PCR fíor-ama.Chun na críche sin, thosaigh eolaithe sinsearacha sa tionscal caighdeáin a fhoirmiú,a cheangal ar rannchuiditheoirí roinnt sonraí turgnamhacha agus próiseála sonraí (lena n-áirítear sonraí riachtanacha) a sholáthar san alt chun na caighdeáin seo a chomhlíonadh .

Is féidir le hathbhreithneoirí cáilíocht an turgnaimh a mheas trí na sonraí seo a léamh;is féidir le léitheoirí na todhchaí é seo a úsáid freisin chun an turgnamh a dhéanamh arís nó chun an turgnamh a fheabhsú.Ansin tá na torthaí turgnamhacha a fhaightear ar an mbealach seo lán faisnéise, ardchaighdeáin, agus inúsáidte.

MIBBI (Faisnéis Íosta le haghaidh Imscrúduithe Bithleighis agus Bithleighis -http://www.mibbi.org) tháinig sé ar an saol.Is tionscadal é MIBBI a sholáthraíonn caighdeáin le haghaidh turgnaimh.Tá sé foilsithe sa nádúr.Tá an tionscadal seo dírithe ar thurgnaimh bhitheolaíocha éagsúla, lena n-áirítear bitheolaíocht cille, Microarray, qPCR táimid ag dul a phlé anois, etc, agus soláthraíonn sé do gach cineál turgnaimh nuair a lámhscríbhinní a chur isteach.Ba cheart an fhaisnéis sin a sholáthar i gcónaí.

I dtionscadal MIBBI, tá dhá alt a bhaineann le PCR cainníochtúil fluaraiseacha, eadhon:
·RDML (Teanga Marcála Sonraí PCR Fíor-Ama) – treoir struchtúrtha teanga agus tuairiscithe le haghaidh sonraí PCR cainníochtúla fíor-ama;
·MIQE (Eolas Íosta chun Turgnaimh PCR Cainníochtúla Fíor-Ama a Fhoilsiú) – íosmhéid faisnéise chun ailt a fhoilsiú faoi thurgnaimh chainníochtúla PCR fíor-ama.
Ar dtús, déanaimis labhairt faoi RDML, an tsonraíocht téarmaíochta.

Mura bhfuil sainmhíniú caighdeánach ar gach rud, ní féidir leanúint leis an bplé, agus is é sin an fáth go bhfuil míniú na dtéarmaí chomh tábhachtach sa scrúdú.
Áirítear an t-ábhar seo a leanas sa téarmaíocht a úsáidtear sa turgnamh cainníochtúil PCR fluaraiseachta.Tá an achoimre is fearr déanta ag QIAGEN dúinn.Seo a leanas gach tirimearraí .

Cuar aimpliúcháin
Tagraíonn an cuar aimpliúcháin don chuar a rinneadh le linn an phróisis PCR, leis an uimhir timthriall mar an abscissa agus an déine fluaraiseachta fíor-ama le linn an imoibrithe mar an ord.

Ba cheart go mbeadh na tréithe seo a leanas ag cuar aimpliúcháin den scoth: tá an bunlíne cothrom nó beagán laghdaithe, agus níl aon treocht aníos soiléir;tá pointe infhillte an chuar soiléir, agus tá fána na céime easpónantúla comhréireach leis an éifeachtúlacht aimpliúcháin.is mó an fána, is airde an éifeachtacht aimplithe;an cuar aimpliúcháin foriomlán Tá an comhthreomharacht go maith, rud a léiríonn go bhfuil éifeachtacht aimplithe gach feadán cosúil;is léir an chéim easpónantúil den chuar aimpliúcháin de shamplaí íseal-tiúchana.

Bunlíne (Bunlíne)
Is é an bunlíne leibhéal torainn an timthrialla luath, a thomhas de ghnáth idir an 3ú agus an 15ú timthriall, toisc nach féidir an méadú ar luach fluaraiseachta de bharr an táirge aimpliúcháin a bhrath le linn na tréimhse seo.Is féidir líon na dtimthriallta a úsáidtear chun an bhunlíne a ríomh a athrú agus d’fhéadfadh go mbeadh gá lena laghdú má úsáidtear méideanna teimpléid arda nó má tá leibhéal slonn na sprice ard.

Chun an bhunlíne a shocrú is gá breathnú ar shonraí fluaraiseachta ón gcuar aimpliúcháin líneach .Socraítear an bhunlíne sa chaoi is go dtosaíonn fás an chuar aimpliúcháin le huimhir thimthriall níos mó ná uimhir bharr na sraithe bonnlíne.Ní mór bunlínte a shocrú ina n-aonar do gach seicheamh sprice.Ní mór na meánluachanna fluaraiseachta a bhraitear sna timthriallta tosaigh a dhealú ó na luachanna fluaraiseachta a fhaightear sna táirgí aimplithe.Ceadaíonn na leaganacha is déanaí de bhogearraí PCR Fíor-Ama éagsúla leas iomlán a bhaint as socruithe bunlíne le haghaidh samplaí aonair.

Le linn na chéad chúpla timthriall den imoibriú aimpliúcháin PCR, ní athraíonn an comhartha fluaraiseachta mórán.Tugtar an bhunlíne ar dhruidim le líne dhíreach, ach má fhéachaimid go géar ar an gcéad chúpla timthriall, feicimid go bhfuil an méid atá ag tarlú sa phictiúr thíos laistigh den bhunlíne.

Cúlra Tagraíonn Cúlra do
an luach fluaraiseachta neamhshonrach san imoibriú .Mar shampla: múchadh fluaraiseachta mí-éifeachtach;nó líon mór teimpléid DNA dúbailte-snáithe mar gheall ar úsáid SYBR Green.Baintear comhpháirteanna cúlra an chomhartha go matamaiticiúil leis an algartam bogearraí PCR Fíor-Ama.

Comhartha tuairisceora
Tagraíonn comhartha tuairisceora don chomhartha fluaraiseachta a ghineann SYBR Green nó taiscéalaithe seicheamh-shonracha lipéadaithe fluaraiseacha le linn PCR Fíor-Ama.

Comhartha Tuairisceora Normalaithe (RN)
Tagraíonn RN do dhéine fhluaraiseachta an ruaim tuairisceora roinnte ar dhéine fhluaraiseachta an ruaim thagartha éighníomhach a thomhaistear ag gach timthriall.

Dath Tagartha Éighníomhach
I roinnt PCRanna Fíor-Ama,úsáidtear an dath fluaraiseacha ROX mar thagairt inmheánach chun an comhartha fluaraiseachta a normalú.Déanann sé ceartú ar éagsúlachtaí de bharr píopaí míchruinn, suíomh an tobair, agus luaineachtaí fluaraiseachta ar bhonn tobair.

An tairseach fluaraiseachta (tairseach)
a choigeartú os cionn an luach cúlra agus go mór faoi bhun luach ardchlár an chuair aimpliúcháin.Caithfidh sé a bheith i réigiún líneach an chuar aimpliúcháin, a léiríonn an raon log-líneach de bhrath PCR.Ba cheart tairseacha a shocrú sa chuar log-aimplithe ionas gur féidir an chéim log-líneach de PCR a aithint go héasca.Má tá ilghéin sprice i PCR Fíor-Ama, ní mór an tairseach a shocrú do gach sprice .Go ginearálta, úsáidtear an comhartha fluaraiseachta den chéad 15 timthriall d'imoibriú PCR mar chomhartha cúlra fluaraiseachta, agus is é an tairseach fluaraiseachta 10 n-uaire an diall caighdeánach de chomhartha fluaraiseachta na chéad 3 go 15 timthriallta de PCR, agus tá an tairseach fluaraiseachta socraithe sa chéim easpónantúil d'aimpliú PCR.Go ginearálta, tá a tairseach fluaraiseachta socraithe ag gach ionstraim roimh úsáid.

Tairseach Rothaíochta (CT) nó Pointe Trasnaithe (CP)
An timthriall ag a dtrasnaíonn an cuar aimpliúcháin an tairseach (ie, an pointe ag a dtagann méadú suntasach ar bhrath fluaraiseachta).Is féidir le CT a bheith ina chodán agus is féidir méid an teimpléid tosaigh a ríomh.Léiríonn an luach CT líon na dtimthriallta a bhfuil taithí acu nuair a shroicheann an comhartha fluaraiseacha i ngach feadán imoibrithe PCR an tairseach socraithe.Tá gaol líneach idir luach CT gach teimpléid agus logarithm uimhir chóip tosaigh an teimpléid, anníos airde an uimhir chóip tosaigh, is lú an luach CT, agus vice versa.Is féidir cuar caighdeánach a dhéanamh trí úsáid a bhaint as caighdeán a bhfuil uimhir na cóipe tosaigh ar eolas aige, ina seasann an abscissa don luach CT, agus seasann an t-ordanáid do logarithm na cóipuimhir tosaigh.Dá bhrí sin, chomh fada agus a fhaightear luach CT an tsampla anaithnid, is féidir uimhir chóip tosaigh an tsampla a ríomh ón gcuar caighdeánach.

luach ΔCT
Déanann luach ΔCT cur síosan difríocht idir an spriocghéine agus luach CT na géine tagartha ingenous comhfhreagrach, cosúil le géine coimeád tí, agus úsáidtear é chun méid an teimpléid a úsáidtear a normalú:
⇒ΔCT = CT (géine sprice) – CT (géine tagartha inghin)

ΔΔCT Luach
Déanann an luach ΔΔCT cur síos ar an difríocht idir meánluach ΔΔCT sampla spéise (m.sh., cealla spreagtha) agus meánluach ΔΔCT sampla tagartha (m.sh., cealla neamhspreagtha).Tugtar an sampla calabrúcháin ar an sampla tagartha freisin agus normalaítear gach sampla eile chuige seo le haghaidh cainníochtú coibhneasta:
⇒ΔΔCT = meán ΔCT (sampla spéise) – meán ΔCT (sampla tagartha)

Géinte tagartha ingineacha (géinte tagartha ingineacha)
Ní hionann leibhéil slonn na ngéinte tagartha ingineacha, amhail géinte coimeádta (géinte coimeádta), idir samplaí.Trí luachanna CT na géine tagartha a chur i gcomparáid leis an spriocghéine is féidir leibhéal slonn na sprice géine a normalú go dtí méid an ionchuir RNA nó cDNA (féach an chuid ar luachanna ΔCT thuas).

Géinte tagartha inmheánacha ceart dodíghrádú RNA féideartha nó láithreacht coscairí einsíme i samplaí RNA, chomh maith le héagsúlachtaí in ábhar RNA, éifeachtúlacht trascríobh droim ar ais, aisghabháil aigéid núicléasaigh, agus láimhseáil samplaí.Chun an ghéin(í) tagartha is fearr a roghnú, rinneamar an t-algartam a mhionathrú chun an tagairt optamach a cheadú ag brath ar an socrú turgnamhach.

Rialú inmheánach
Seicheamh rialaithe a aimplítear san imoibriú céanna leis an seicheamh sprice agus a phrobháiltear le taiscéalaí eile (.i. PCR déphléacsacha a dhéanamh).Is minic a úsáidtear rialuithe inmheánacha chun aimplithe teipthe a chur as an áireamh, mar nuair nach mbraitear an seicheamh sprice.
Sampla Calabrúcháin
Sampla tagartha (mar shampla, RNA íonaithe ó líne chill nó fíochán) a úsáidtear i gcainníochtú coibhneasta chun gach sampla eile a chur i gcomparáid chun leibhéal slonn coibhneasta géine a chinneadh.Is féidir le sampla calabrúcháin a bheith ina shampla ar bith, ach is gnách é a rialú (mar shampla, sampla neamhchóireáilte nó sampla ó am náid an turgnaimh).

rialuithe dearfacha
imoibrithe rialaithe a úsáid leméideanna aitheanta teimpléid.Is minic a úsáidtear rialuithe dearfacha chun a sheiceáil go bhfuil tacar primer nó priméir-lorgaire ag oibriú i gceart agus go bhfuil an t-imoibriú socraithe i gceart.

Gan Rialú Teimpléad (NTC)
Imoibriú rialaithe ina bhfuil na comhpháirteanna uile is gá den imoibriú aimpliúcháin ach amháin an teimpléad, a chuirtear in ionad uisce de ghnáth.Is féidir le húsáid NTC teacht ar an éilliú de bharr éillithe imoibrí nó DNA eachtrach, rud a chinntíonn barántúlacht agus iontaofacht na sonraí braite.Léiríonn aimpliú an rialaithe NTC éilliú.

Gan rialú RT (NRT)
Féadfaidh DNA géanóm iarmharach a bheith i bpróiseas eastósctha RNA, atá thar a bheith díobhálach agus is é an culprit a dhéanann difear do cháilíocht sonraí agus namhaid nádúrtha qPCR, agus mar sin nuair a bhíonn turgnaimh á ndearadh, ní mór é a dhearadh chun ach braite RNA a mhéadú.Tá dhá bhealach ann, is é ceann amháin primers a dhearadh thar introns, is é an ceann eile DNA a bhaint go hiomlán, cé acu ceann is fearr, a phléifear níos déanaí.Is scáthán draíochta é an rialú NTR chun truailliú DNA a bhrath.Má tá aimpliú ann, ciallaíonn sé go bhfuil truailliú ann.

Caighdeáin
Is éard is caighdeáin ann ná samplaí de thiúchan aitheanta nó d’uimhir chóip a úsáidtear chun cuar caighdeánach a dhéanamh.D'fhonn cobhsaíocht an chaighdeáin a áirithiú, de ghnáth déantar an blúire géine a chlónáil isteach sa plasmid agus a úsáid mar chaighdeán.

An cuar caighdeánach
caolaithe de ghnáth i 5 grádán tiúchana ar a laghad leis an táirge caighdeánach de réir an chóimheas dúbailte, agus tarraingítear 5 phointe i gcomhordanáidí luach CT agus uimhir chóip, agus tá na pointí ceangailte chun líne a dhéanamh chun cuar caighdeánach a ghiniúint.I gcás gach cuar caighdeánach, ní mór a bhailíocht a sheiceáil.Titeann an luach fána idir –3.3 agus –3.8, agus déantar gach tiúchan ina thrí oiread.Ba cheart pointí atá an-difriúil ó phointí eile a chaitheamh i leataobh.Tugtar luach CT an tsampla atá le tástáil isteach sa chuar caighdeánach, agus is féidir leibhéal slonn an tsampla atá le tástáil a ríomh.

Tugtar luach CT an tsampla atá le tástáil isteach sa chuar caighdeánach, agus is féidir uimhir chóip tosaigh an tsampla atá le tástáil a ríomh.

Éifeachtúlacht agus Fána
Léiríonn fána an chuar chaighdeánaigh éifeachtacht PCR fíor-ama.
·Léiríonn fána de -3.322 go bhfuil an éifeachtacht aimplithe PCR 1, nó 100% éifeachtach, agus dúbailt méid an táirge PCR ag gach timthriall.
·Léiríonn fána níos lú ná –3.322 (eg, –3.8) éifeachtacht PCR
·Léiríonn fána níos mó ná –3.322 (m.sh., –3.0) gur dealraitheach go bhfuil an éifeachtúlacht PCR níos mó ná 100%, rud atá aisteach, conas a d’fhéadfadh timthriall amháin PCR an táirge aimplithe a ghiniúint níos mó ná dhá oiread?Tarlaíonn an staid seo i gcéim neamhlíneach an imoibrithe PCR, is é sin, tá méid mór aimplithe neamh-shonrach ann.

cuar leá
Tar éis an aimpliú qPCR a chríochnú, téitear an táirge PCR.De réir mar a ardaíonn an teocht, leáigh an táirge aimpliúcháin dhá-shnáithe de réir a chéile, rud a fhágann go laghdaítear déine fluaraiseachta.Nuair a shroichtear teocht áirithe (Tm), leáfaidh líon mór táirgí.Titeann an fhluaraiseacht go géar.Tá luachanna Tm éagsúla agus teochtaí leá éagsúla ag táirgí PCR éagsúla, ionas gur féidir sainiúlacht PCR a aithint.

Cuar leá (cuar díorthach)
Díorthaítear an cuar leá chun buaicléarscáil a chruthú, a fhéadfaidh staid na blúirí táirge PCR a thaispeáint ar bhealach níos intuigthe.Ós rud é gurb é an teocht leá ná luach Tm an blúire DNA, is féidir roinnt paraiméadair a dhéanann difear do luach Tm an bhlúire DNA a mheas, mar shampla méid blúirí, ábhar GC, etc. Go ginearálta, de réir ár bprionsabail dearaidh primer,tá fad an táirge aimplithe sa raon 80-300bp, mar sin ba chóir go mbeadh an teocht leá idir 80 ° C agus 90 ° C.

Léiriú ar an gcuar leá: Má tá an t-aon phríomhbhuaic le feiceáil idir 80°C-90°C, ciallaíonn sé go bhfuil an PCR cainníochtúil fluaraiseacha foirfe;má tá an chuma ar an bpríomhbhuaic idir 80°C-90°C agus go bhfuil beanna ilghnéitheacha faoi bhun 80°C, meastar go bunúsach an dimer primer.Is féidir leat iarracht a dhéanamh an teocht annealing a mhéadú chun é a réiteach;má tá an príomh-bhuaic le feiceáil idir 80°C-90°C, agus an bhuaic ilghnéitheach le feiceáil arís nuair a ardaíonn an teocht, meastar go bunúsach go bhfuil éilliú DNA ann, agus ní mór DNA a bhaint ag céim tosaigh an turgnaimh.

Ar ndóigh, tá roinnt cásanna neamhghnácha ann fós, a bhriseadh síos ceann ar cheann thíos.
3. Ard-eolas

Chun qPCR a dhéanamh, caithfidh mé MIQE a rá,Eolas Íostale Foilsiú naCainníochtúilPCR fíor-amaTurgnaimh — an t-íosmhéid faisnéise chun ailt a fhoilsiú faoi PCR cainníochtúil fíor-amaturgnaimh .D'fhonn tuiscint gach duine a shimpliú, déanfaimid an príomh-ábhar a shimpliú.

Is féidir leat téacs bunaidh MIQE a chuardach ar an Idirlíon, agus is é an rud is tábhachtaí ná go n-ordaíonn sé anseicliosta sonraí nach mór a sholáthar agus alt á fhoilsiú .

Is féidir le hathbhreithneoirí cáilíocht an turgnaimh a mheas trí na sonraí seo a léamh;is féidir le léitheoirí na todhchaí é seo a úsáid freisin chun an turgnamh a dhéanamh arís nó a fheabhsú.
Is fiú a thabhairt faoi deara go bhfuil an tábhacht a bhaineann le gach liosta marcáilte le E nó D faoi seach sa liosta seo.Céard is brí leis?E: faisnéis riachtanach (ní mór í a chur isteach);D: faisnéis inmhianaithe (soláthair oiread agus is féidir).

MIQE (1)—Dearadh Turgnamhach
Ní bheidh a fhios ag go leor scumbags a chríochnaigh a gcosaint tar éis dóibh a gcuid staidéir iarchéime a dhéanamh conas turgnamh a dhearadh go neamhspleách, a leabhair nótaí a oscailt, agus an méid a insíonn an múinteoir dóibh a dhéanamh.Mar thoradh air sin, ní raibh an dearadh turgnamhach dian, agus dúirt roinn eagarthóireachta na hirise go raibh siad ag iarraidh an pictiúr seo agus an pictiúr sin a dhéanamh suas, agus mar sin rinne siad é i daze.Seo mar a dhéantar na scumbags!

Níos gaire don bhaile, is é an chéad phrionsabal den turgnamh a chinneadhdéine na loighice turgnamhaí.Is é an rud is bunúsaí ná an dearadh turgnamhach, agus is é an rud is tábhachtaí faoin dearadh turgnamhach ná conas an spriocshampla, an sampla tagartha (rialú), agus líon na n-athrá a shocrú, ionas gur féidir tagairt a dhéanamh ar na sonraí turgnamhacha, inchomparáide, agus ina luí.

An sprioc samplatagairt don sampla a éilíonn orainn an spriocghéine a bhrath tar éis cóireála áirithe.An sampla tagarthaan sampla gan aon chóireáil, ar a dtugtar go minic mar chineál fiáin sa bhitheolaíocht.

Macasamhlacha turgnamhachaan-tábhachtach.Go ginearálta, caithfidh líon na macasamhla áititheacha a bheith níos mó ná trí cinn.Is gá idirdhealú a dhéanamh idir cad is macasamhlú bitheolaíoch ann agus cad is macasamhlú teicniúil ann.

Macasamhlacha Bitheolaíochta: An turgnamh fíorúcháin céanna a rinneadh le hábhair éagsúla (am, plandaí, baisceanna, plátaí imoibrithe).

Dúbailt bhitheolaíoch
A ligean ar ghlacadh an chóireáil lotnaidicídí piobar mar shampla.Ba mhaith linn lotnaidicídí a spraeáil ar na trí phlandaí ABC, ansin is trí mhacasamhlú bitheolaíochta iad na trí phlandaí ABC, agus is iad an turgnamh fíorúcháin céanna a dhéantar le hábhair éagsúla.Ach mar thurgnamh, tá gá le rialú cinnte, ionas gur féidir linn ceann de na brainsí de phlanda A a spraeáil chun grúpa turgnamhach de phlanda A a fhoirmiú, agus gan na brainsí eile de phlanda A a spraeáil chun grúpa rialaithe a fhoirmiú.Déan mar an gcéanna do B agus C.

Macasamhlacha Teicniúla (Macasamhlacha Teicniúla): Is turgnamh arís agus arís eile é atá deartha chun earráidí de bharr oibríochta a sheachaint, rud atá i ndáiríre ina pholl dúblach san ábhar céanna.Caithfidh socruithe macasamhlaithe (íosmhéid trí cinn) den spriocghéine agus den ghéin thagartha inmheánach a bheith ag an dá chóireáil agus rialú.

Athrá teicniúil
Glac an piobar cóireáilte le lotnaidicídí mar shampla arís.Maidir leis an ngrúpa turgnamhach de phlanda A, rinneamar trí pholl PCR de 1, 2, agus 3 dá spriocghéine agus géine tagartha inmheánach faoi seach, chun an meán a ghlacadh tar éis an bhrath.Chun gléasra a rialú, caitear le Grúpaí A ar an mbealach céanna freisin.Ar an gcaoi chéanna, déan an chóireáil chéanna do phlandaí B agus C.Is athrá teicniúil é seo.

Is fiú a nótáil gois é an rud a thagann isteach sa staidreamh ná an athrá bitheolaíoch, agus is é an athrá teicniúil ná tástáil a dhéanamh an bhfuil aon fheiniméin randamach sa phróiseas turgnamhach, ionas go mbeidh na torthaí turgnamhacha inchreidte, is é sin, earráidí a sheachaint trína meán a ghlacadh mar a deirimid go minic.

Rialuithe Diúltacha - NTC agus NRT
NTC (Rialú Gan Teimpléad), rialú gan teimpléad, a úsáidtear chun a fhíorú an bhfuil an t-ábhar turgnamhach éillithe.Go ginearálta, úsáidtear uisce mar theimpléad.Má tá imoibriú fluaraiseacha ann, léiríonn sé gur tharla éilliú aigéid núicléacha sa tsaotharlann.

Tagann na truaillithe seo ó: uisce eisíon, imoibrithe neamhcháilithe ina bhfuil DNA endogenous, truailliú primer, truailliú trealamh saotharlainne, truailliú aerasóil, etc., gá úsáid a bhaint as scavengers RNase agus coscairí RNase.Is é an truailliú aerasóil an ceann is deacra le fáil.Samhlaigh go bhfuil do shaotharlann cosúil le toitcheo, agus aigéid núicléacha éagsúla ar crochadh san aer.

NRT (Tras-scríobh Gan Droim ar Ais), an rialú gan trascríobh droim ar ais, is é an RNA tras-scríofa neamh-droim ar ais mar rialú diúltach, arb é rialú iarmhar gDNA.

Agus léiriú géine á dhéanamh, déantar méid RNA a bhrath trí mhéid cDNA a bhrath tar éis trascríobh droim ar ais.Má tá iarmhar gDNA ann nuair a dhéantar RNA a íonú, beidh sé ina chúis le hearráidí sna torthaí turgnamhacha, toisc gurb iad gDNA agus cDNA na torthaí iarbhír a fhaightear.Ag an leibhéal comhiomlán, ní hamháin cDNA, ní mór gDNA a bhaint go hiomlán le linn eastóscadh RNA.

MIQE (2) — faisnéis shamplach
Ciallaíonn an t-eolas samplach mar a thugtar air, nuair a fhoilsímid alt faoi qPCR, ní mór dúinn an t-eolas samplach a mhíniú go soiléir, rud atá mar chuid fíor-riachtanach den alt.Ar an gcaoi chéanna, nuair a dhéanaimid samplaí a phróiseáil, ní mór dúinn ár n-oibríochtaí féin a rialáil freisin chun bailíocht na samplaí a chinntiú.

Níl ach toradh ag cur síos ar an sampla, agus ba cheart dúinn aird níos mó a thabhairt ar na hábhair a tógadh le linn an turgnaimh ar fad.

Roghnú ábhar turgnamhach
Samplaí fola – roghnaigh fuil úr, gan a bheith níos faide ná 4 huaire an chloig.Samplaí cille – roghnaigh cealla úra a bhailiú i dtréimhse fáis bhríomhar.Fíocháin Ainmhithe - Roghnaigh fíochán úr atá ag fás go tréan.Fíochán Planda – Roghnaigh fíochán úr óg.

Caithfidh tú a bheith tugtha faoi deara go bhfuil eochairfhocal sna cúpla abairt seo: úr .
Maidir leis na samplaí thuas, is é an trealamh is fearr, cost-éifeachtach agus cobhsaí ar an margadh ná trealamh Foregene, ar féidir leo a DNA agus RNA a bhaint go tapa agus go héasca.

Fola DNA Mini Kit

Kit Iomlán Leithlisiú RNA Cille

Trealamh Leithlisithe RNA Iomlán Ainmhithe

Gléasra Trealamh Leithlisithe RNA Iomlán

Gléasra Kit Leithlisiú Iomlán RNA Plus

Trealamh Aonrú DNA Plandaí

Stóráil ábhar turgnamhach
Go ginearálta, ní mholtar samplaí a stóráil, má cheadaíonn na coinníollacha.Mar sin féin, tá go leor cairde ann nach féidir leo turgnaimh a dhéanamh díreach tar éis samplála, agus caithfidh cuid acu fiú umair nítrigine leachtacha a iompar go dtí an réimse le haghaidh samplála.

Maidir leis an gcineál seo cara dícheallach, ní féidir liom a rá ach nach dtuigeann tú earraí inchaite imoibrí.Anois táirgeann go leor cuideachtaí inchaite imoibrí imoibrithe ar féidir leo samplaí RNA a stóráil ag teocht an tseomra, agus is féidir leat a roghnú iad a úsáid.Is é an modh stórála traidisiúnta ná stóráil nítrigine leachtach, ag baint úsáide as umar nítrigine beag leachtach atá éasca le iompar.Tar éis duit an sampla a thabhairt ar ais go dtí an tsaotharlann, stóráil i gcuisneoir -80°C é.

I gcás turgnaimh a bhaineann le RNA, ní mór an prionsabal sé fhocal a leanúint:teocht íseal , gan aon einsímí ,agustapa .

Is furasta coincheap an teocht íseal a thuiscint;gan einsímí, tá RNase i ngach áit ar domhan ina mairimid (ar shlí eile bheadh ​​VEID maraithe agat), agus mar sin is coincheap an-tábhachtach é conas RNase a sheachaint agus turgnaimh á dhéanamh;tapa,Níl aon Kung Fu ar domhan nach féidir a bhriseadh, ní féidir ach luas a bhriseadh.

Dá bhrí sin, ar bhealach, dá giorra an t-am eastósctha, is amhlaidh is fearr an trealamh.Cén fáth a dhéanannEachtrannach's trealamh béim a chur ar luas, mar tá a fhios acu go maith é.

PS: Déanann cailíní áirithe turgnaimh go han-chúramach, ach níl siad chomh maith le slam dunk tar éis roinnt blianta oibre.Mothaíonn siad go bhfuil Dia éagórach, ag gearán faoi dhaoine eile, agus ag lorg beatha.Le fírinne, níor thuig sí é.Níor chosain sé an RNA go maith, agus bhí an t-imreoir slam dunk nimble.Nuair a bhí an turgnamh á dhéanamh aige, cheap sé go gcríochnódh sé an slam dunk le trí huaire, cúig huaire agus dhá roinn, ach rinne sé an turgnamh go maith.

Nóta: Níos moille, seans níos mó d'ionradh RNase.Conas tú féin a oiliúint le bheith tapa?Níl aon bhealach, ach cleachtadh níos mó.

Le haghaidh turgnaimh éagsúla agus samplaí éagsúla, tá sé riachtanach fós níos mó litríochta a léamh agus modh próiseála cuí a roghnú.Maidir leis an bpróiseas bailiúcháin agus stórála samplaí, éilíonn MIQE go gcaithfidh sé a bheith scríofa go soiléir sa pháipéar, ionas gur féidir leis na hathbhreithneoirí athbhreithniú a dhéanamh ar iontaofacht an pháipéir, agus tá sé áisiúil freisin do na daoine óga stunned do thurgnamh a dhéanamh arís.

Cé go bhfuil turgnaimh bhitheolaíocha deacair, tá siad ard-deireadh.Mura bhfuil tú cúramach, is féidir leat an domhan a chur ar ceal.Mar shampla, SARS a dhéanamh i ngéarchéim bithcheimiceach, nó rís hibrideach a dhéanamh chun 1.3 billiún duine a shábháil.Is turgnamh ceimiceach é an pictiúr thíos, ba cheart duit a thuiscint cé chomh bródúil agus atá tú as do chuid taighde ach breathnú ar a chuma atá cosúil le dick.Déan dearmad air, ná cuir dubh air.

MIQE (3) – eastóscadh aigéid núicléacha.
Is ócáid ​​​​mhór é eastóscadh aigéad núicléasach, agus tosaíonn gach turgnamh bitheolaíochta móilíneach le eastóscadh aigéad núicléasach.Ar an gcéad dul síos, déanaimis ábhar MIQE ar eastóscadh aigéid núicléacha a chóipeáil.

Ag féachaint ar an bhfoirm seo, ní féidir leat fanacht ar an dromchla.Is dogma an fhoirm.Le bheith i do dhalta den scoth, caithfidh tú fiafraí cén fáth.Is é bunábhar an tábla seo ná: Tóiríonacht, sláine, comhsheasmhacht, agus méid eastósctha RNA .

An chéad chuid denIs é próiseas nó ionstraim an chéim eastóscadh aigéid núicléacha.Má úsáideann tú eastóscadh uathoibríoch aigéid núicléacha chun sliocht (chun cinn, déan teagmháil liom le do cheannach), ní mór duit ainm samhail na hionstraime a chur in iúl.

Ainm an feiste agus

cén trealamh a úsáideadh do shonraí an athraithe, cad iad na himoibrithe speisialta a cuireadh leis nó cad iad na hoibríochtaí speisialta a rinneadh, ba chóir iad a mhíniú go soiléir ionas gur féidir le daoine eile do thurgnamh a dhéanamh arís go héasca.

Cuireann roinnt daoine imoibrithe speisialta leis agus iad ag baint samplaí speisialta, ag smaoineamh gurb é seo a n-arm rúnda agus nach n-insíonn siad do dhaoine eile.Cé go gcoinníonn siad faoi rún é, cailleann siad an deis freisin d'alt a dhéanamh níos gile.Ná bheith cliste, caithfidh tú a bheith níos macánta ná an tír Zhang d'aois i dtaighde eolaíoch, más mian leat a bheith cliste, beidh an t-alt a dhéanamh dúr tú.

Ní mór cuimhneamh ar an uimhir táirge ar an trealamhnuair a ordaíonn tú an trealamh agus nuair a scríobhann tú an t-alt.Go ginearálta tá dhá uimhir ar an trealamh: cat-uimhir catalóige (uimhir táirge, uimhir earra), Lot – uimhir táirge lot (Úsáidte chun a chur in iúl cén baisc as ar tháinig an táirge).

Ina theannta sin, is minic a úsáidtear an uimhir CAS nuair a bhíonn imoibrithe bithcheimiceacha á ordú, agus déanfaidh mé tóir air le chéile.Is í an uimhir CAS an uimhir a thugann an American Chemical Society do gach druga ceimiceach nua.Go ginearálta, tá trí uimhir ceangailte le dash.Uimhir CAS Rushui: 7732-18-5.Is minic a bhíonn ailiasanna iolracha ag ceimiceáin, ach tá an uimhir CAS uathúil.Agus leigheas á ordú agat, is féidir leat a uimhir CAS a sheiceáil ar dtús.

Níos gaire don bhaile, cén fáth go gcaithfimid cur síos soiléir a dhéanamh ar na rudaí seo?Go deimhin, tá sé freisin chun cáilíocht eastóscadh RNA a sheiceáil.Má úsáidtear uirlisí agus feisteáin beidh eastóscadh RNA níos comhsheasmhaí.Níl scála eastóscadh gnáth-saotharlanna mór, agus is féidir é a fháil le feisteáin.

Sonraí na cóireála DNase nó RNase
Is í an tsaincheist thábhachtach a bhaineann le PCR cainníochtúil fluaraiseacha ná éilliú DNA a chosc, agus ná déan turgnamh má tá éilliú ann.Mar sin, tá sé ríthábhachtach an próiseas a d'úsáid tú chun an DNA a phróiseáil a lua, chun a léiriú go bhfuil an DNA sa phróiseas turgnamhach bainte go hiomlán agus go hiomlán.léirithe ag léaráid scéimreach.

Léaráid scéimreach de RNA agus DNA
Go ginearálta, is é an modh chun DNA a bhaint ná RNA a chóireáil le DNase tar éis eastóscadh.Mar sin féin, is modhanna sách sean iad seo.Bhí feisteáin eastósctha RNA tráchtála in ann DNA a bhaint le linn an phróisis eastósctha gan DNase a chur leis.Mar shampla, sraith feisteáin ó Foregene .

Nóta: Is claíomh dúbailte-imeall an-chontúirteach é DNA a bhaint le linn eastóscadh RNA, rud a shíneoidh am oibríochta eastóscadh RNA agus a mhéadóidh an baol díghrádaithe RNA.Go bunúsach, is comhbhabhtáil é idir toradh RNA agus íonacht.

Ina theannta sin, tá an méid DNase a chuirtear leis an gcolún asaithe atá bunaithe ar shilice an-bheag, agus ní mór DNase ardchaighdeáin a úsáid chun an éifeacht a bhaint amach.Ní féidir DNA neamhoptamaithe a dhíleá go tapa agus go hiomlán.Is tástáil é seo ar leibhéal teicniúil an cheannaí.Ar ndóigh, tá fiú níos mó ceannaithe aisteach a boast gur féidir DNA a bhaint gan DNase.Is féidir a rá gur masla é duine ar bith a brags gur féidir DNA a bhaint go hiomlán gan DNase.Is struchtúr réasúnta seasmhach é DNA snáithe dúbailte, agus ní féidir é a scriosadh amach ach ag caint agus ag gáire.

Measúnú éillithe
modh measúnaithe: braite leictreafóiréis, agarose 1%, 6V/cm, 15min, luchtú 1-3 ul

Anailís chainníochtúil ar aigéad núicléasach
déantar é a thomhas de ghnáth trí úsáid a bhaint as speictreafótaiméadar UV.Lig dom brí na dtrí luach OD260, OD280, agus OD230 a ráthú ar dtús.
·OD260nm: Is é an tonnfhad ionsúcháin den bhuaic ionsúcháin is airde d'aigéad núicléach, agus raonta an luach tomhaiste is fearr ó 0.1 go 1.0.Mura bhfuil, caolaigh nó comhchruinnigh an sampla chun é a thabhairt laistigh den raon.
·OD280nm: Is é an tonnfhad ionsú an bhuaic ionsú is airde de próitéine agus substaintí feanólacha.
·OD230nm: Is é an tonnfhad ionsú an bhuaic ionsú is airde de carbaihiodráití.

Ansin, déanaimis labhairt faoi ról gach táscaire.I gcás A260, is féidir é a úsáid chun táirgeacht aigéid núicléigh a thomhas.Nuair a bheidh OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Ar mhaithe le híonacht, ní mór dúinn breathnú ar na cóimheasa a fheicimid go coitianta: OD260/280 agus OD260/230.
·DNA íon: Tá OD260/280 timpeall cothrom le 1.8.Nuair a bhíonn sé níos mó ná 1.9, léiríonn sé go bhfuil truailliú RNA ann, agus nuair a bhíonn sé níos lú ná 1.6, léiríonn sé go bhfuil truailliú próitéine agus feanól ann.
· RNA íon: 1.7
·OD260/230: Cibé an DNA nó RNA é, is é 2.5 an luach tagartha.Nuair a bhíonn sé níos lú ná 2.0, léiríonn sé go bhfuil truailliú siúcra, salann agus ábhar orgánach.

Sláine RNA

Tá sé an-tábhachtach sláine RNA a thomhas.Go ginearálta, is gá turgnamh glóthach dínádúraithe RNA a dhéanamh chun a sheiceáil an bhfuil an gile idir 28S agus 18S RNA caidreamh dhá-fhillte.Nuair a bhíonn an tríú banna 5S le feiceáil, ciallaíonn sé go bhfuil an RNA tosaithe ag díghrádú, ach amháin inveirteabraigh.

Sonraí maidir le measúnú cáilíochta RNA: Chomh maith leis na tástálacha thuas, tá roinnt tástálacha ionstraime níos airde ann freisin maidir le sláine RNA, mar shampla tástáil sláine RQI ar chóras leictreafóiréis uathoibríoch Experion, a fhéadfaidh a bhrath an bhfuil RNA díghrádaithe dofheicthe.

I dtaighde eolaíoch, is comparáid idir an spriocghéine agus an ghéin thagartha inmheánach é PCR cainníochtúil fluaraiseacha.Mar sin, i bpróiseas caomhnú sampla RNA, eastóscadh RNA, etc., is é an príomhsprioc ná sláine RNA a chinntiú.

Is furasta a thuiscint ón bhfíor thíos conas a théann sláine RNA i bhfeidhm ar an gcothromaíocht idir an spriocghéine agus an ghéin thagartha inmheánach.Beidh díghrádú mar thoradh ar neamhchruinneas géine, cibé an neamhiomlán an ghéine tagartha inmheánaigh nó neamhiomlán an spriocghéine é, beidh tionchar mór aige ar na sonraí.

Níor cheart go mbeadh léaráid scéimreach den spriocghéine agus den ghéin thagartha fíor

Tástáil um chosc (cibé an bhfuil an luach CT faoi chois faoi thiúchan ard nó íseal nó faoi choinníollacha eile)

Ag glacadh leis an bhfigiúr seo mar shampla, is iad seo a leanas luachanna Ct na gcúig chuar.Tá dáileadh na luachanna CT idir na cuair míchothrom, agus cuirtear moill ar na luachanna Ct faoi chomhchruinnithe ard agus íseal, is é sin an cás ar chosc PCR.

Príomhphointe: Sa phróiseas eastóscadh RNA, ní mór dúinn míthuiscintí a thréigean agus cinn cearta a bhunú.

Is é an smaoineamh mícheart: ní leanann eastóscadh RNA ach an toradh, ag smaoineamh dá mó an méid RNA a fhaightear, is amhlaidh is fearr.Go deimhin, nuair a dhéanaimid cainníochtú, mura bhfuil líon na ngéinte an-mhór, níl mórán RNA ag teastáil uainn.Is mó ná go leor an méid RNA a bhaintear as.

Is é an coincheap ceart:Ba cheart go ndéanfadh eastóscadh RNA íonacht, sláine agus comhsheasmhacht a shaothrú.Is féidir leis an íonacht a chinntiú nach gcuirtear bac ar an trascríobh droim ar ais ina dhiaidh sin agus nach mbeidh tionchar ag DNA ar na sonraí.Cinntíonn sláine cothromaíocht na seicheamh sprice agus na tagairtí inmheánacha.Cinntíonn comhsheasmhacht luchtú samplach cobhsaí.

MIQE (4) – trascríobh droim ar ais
Míthuiscint: an tóir ar líon sampla níos airde.
Coincheap ceart: Leanúint ar chomhsheasmhacht (cobhsaíocht), beag beann ar an méid RNA luchtaithe, tá éifeachtacht trascríobh droim ar ais comhsheasmhach, ag cinntiú gur féidir le difríochtaí i cDNA difríochtaí i mRNA a léiriú go fírinneach.
Mínímid an próiseas seo le léaráid scéimreach:

Léaráid scéimreach d'éifeachtúlacht trascríobh droim ar ais, ná a bheith fíor
Ar an gcéad dul síos, ní mór dúinn an difríocht idir an próiseas trascríobh droim ar ais agus an próiseas PCR a thuiscint.Téann PCR faoi phróisis iolracha téimh agus annealaithe, agus fásann an spriocbhlúire go heaspónantúil;cé nach bhfuil an próiseas seo ag tras-scríobh droim ar ais, is féidir linn a shamhlú go bhfuil an trascríobh droim ar ais i ndáiríre duine-le-duine Le linn an phróisis macasamhlaithe, mar go leor píosaí RNA

toisc gur féidir an oiread píosaí Faisnéise cDNA a fháil, ba cheart é a thuiscint faoin am seo, toisc go bhfuil blúirí móra agus beaga tras-scríofa ar ais, agus ní féidir díriú ar blúire amháin.Agus toisc go bhfuil an méid RNA sách beag, tá an méid cDNA a fhaightear sách beag freisin, murab ionann agus PCR, a bhfuil éifeacht aimplithe aige, agus mar sin tá sé dodhéanta go bunúsach a bhrath.

torthaí leictreafóiréis cDNA
Ar an dara dul síos, go hidéalach, déantar trascríobh droim ar ais duine le duine, ach ní féidir le haon tras-scríbhinn droim ar ais ó chuideachta ar bith an éifeacht seo a bhaint amach.Go bunúsach, tá éifeachtúlacht an chuid is mó tras-scríbhinní droim ar ais idir 30-50%.Más é seo an cás, b'fhearr linn éifeachtacht trascríobh droim ar ais réasúnta cobhsaí a bheith againn, agus is é sin an méid is mian linn a fheiceáil san fhigiúr: faigheann 3 RNA 2 cDNA, faigheann 6 RNA 4 cDNA, mar sin is cuma cé mhéad sampla atá luchtaithe, tá an éifeachtacht trascríobh droim ar ais sách cobhsaí.Nílimid ag iarraidh an cás a fheiceáil ina bhfuil éifeachtúlacht trascríobh droim ar ais éagobhsaí agus ina gcuirtear bac ar ardchruinniú.

Mar sin, conas a fhíorú an bhfuil an éifeachtacht trascríobh droim ar ais cobhsaí?Tá an modh an-simplí, ní mór duit ach tástáil chomparáide a dhéanamh: is é ceann amháin tras-scríobh a aisiompú go cDNA tar éis caolú RNA a dhúbailt, agus is é an ceann eile caolú dúbailt a dhéanamh tar éis tras-scríobh droim ar ais go cDNA, agus ansin qPCR a dhéanamh chun an fána a fhaightear a fheiceáil An bhfuil sé comhsheasmhach.Mar mhac léinn den scoth, ba cheart duit é a thuiscint i soicindí.Mar a léirítear thíos:

Caolú RNA agus cDNA chun a thástáil an bhfuil éifeachtúlacht an trascríobh droim ar ais cobhsaí
Trascríobh droim ar ais agus trealamh
Conas is féidir le PCR cainníochtúla fluaraiseacha foirfe trascríobh agus trealamh droim ar ais den scoth a bheith ann.Tá transcriptase droim ar ais roinnte go garbh ina dhá chineál de réir na foinse, AMV nóM-MLV, agus tá a bhfeidhmíocht mar an gcéanna leis an gceann a thaispeántar sa tábla.

Gníomhaíocht RNase H
Is é RNase H ná Ribonuclease H, is é an t-ainm Síneach ribonuclease H, ar endoribonuclease é a fhéadfaidh RNA a hidrealú go sonrach sa slabhra hibrideach DNA-RNA.Ní féidir le RNase H na naisc fosfadiester a hidrealú i DNA nó RNA aonshnáithe nó dúbailte, is é sin, ní féidir leis DNA nó RNA aonshnáithe nó dúbailte-snáithe a dhíolama.Úsáidtear go coitianta i sintéis an dara sraith de cDNA.

Is aisteach an rud é.Deirimid go bhfuil gníomhaíocht RNase H ag an transcriptase droim ar ais, ní go bhfuil RNase H ann sa transcriptase droim ar ais, agus b'fhéidir nach mbeifear in ann RNase H a scaradh ó transcriptase droim ar ais, b'fhéidir mar gheall ar chomhfhoirmiú grúpaí áirithe i transcriptase droim ar ais.

Mar sin, beag beann ar éifeachtacht trascríobh droim ar ais níos airde AMV, laghdaíonn a ghníomhaíocht RNase H toradh cDNA.Ar ndóigh, tá monaróirí imoibrí i gcónaí ag uasmhéadú a gcuid táirgí chun deireadh a chur le gníomhaíocht RNase H i transcriptase droim ar ais a oiread agus is féidir chun toradh cDNA a mhéadú.
Teocht annealing

Struchtúr tánaisteach RNA ag teochtaí éagsúla
Féach ar an bhfigiúr thuas le haghaidh struchtúr tánaisteach RNA ag teochtaí éagsúla, agus bain úsáid as an uirlis ar líne mFold chun struchtúr tánaisteach an bhlúire sprice a chinneadh faoi choinníollacha sonracha teochta agus tiúchan salainn.Ag 55 ° C, tá struchtúr tánaisteach an RNA fós an-chasta, ní féidir le transcriptase droim ar ais a bheith ag obair, agus ní féidir an struchtúr tánaisteach a réiteach go hiomlán go dtí 65 ° C, agus tá an teocht is fearr is féidir AMV agus M-MLV i bhfad níos ísle ná an teocht seo.
Cad atá le déanamh?Is é an struchtúr tánaisteach péireáil chomhlántach an teimpléid féin, rud a fhágann go bhfuil iomaíocht láidir idir an primer agus an transcriptase droim ar ais agus an teimpléad, rud a fhágann go bhfuil sraith fadhbanna cosúil le E íseal agus droch-atrialltacht.

Cad atá le déanamh?Ná méadaigh ach an teocht annealaithe oiread agus is féidir.

Tá go leor déantúsóirí imoibrí ag feabhsú a n-athscríbhinní droim ar ais trí innealtóireacht ghéiniteach.Méadaíonn cuid acu an teocht imoibrithe, mar shampla Jifan agus Aidelai, agus baineann cuid acu an grúpa gníomhach einsím RNase H chun an cleamhnas idir an einsím agus an teimpléad RNA a fheabhsú.Is féidir le cleamhnas ard an struchtúr tánaisteach a bhrú amach go hiomaíoch agus léamh tríd go réidh, agus feabhas mór a chur ar éifeachtúlacht an trascríobh droim ar ais.
Príomhphointe: Tá an trascríobh droim ar ais níos tábhachtaí chun comhsheasmhacht na héifeachtúlachta trascríobh droim ar ais a shaothrú (ní hamháin go bhfuil einsímí éifeachtach ach freisin cobhsaí), seachas méid an tsampla luchtaithe, más rud é nach PCR cainníochtúil fluaraiseachta go háirithe ar scála mór é, ní bheidh sé indéanta ar chor ar bith.CDNAanna iolracha.
Tá roinnt iarrachtaí déanta ag monaróirí éagsúla freisin chun comhsheasmhacht a bhaint amach.Mar shampla, tá trascríobh droim ar ais pacáistithe ag formhór na gcuideachtaí mar threalamh caighdeánach le díol, rud is rogha mhaith.
Mar shampla, feisteáin Foregene's RT Easy Series:

RT Easy I (Príomhréamh-mheascán do threalamh sintéise cDNA an chéad snáithe)

MIQE (5) – faisnéis faoi ghéinte sprice

Míníonn an figiúr thuas
1. Is féidir le turgnaimh arís agus arís eile a fhíorú cibé an bhfuil an géine seo éifeachtach le haghaidh turgnaimh arís agus arís eile.
2. Gene ID, tá a fhios agat.
3. Fad géine, is cinnte nach bhfuil fadhb ar bith ag fad iomlán na géine sprice.Agus primers á dhearadh, cinntigh go bhfuil fad an aimplicon idir 80-200bp chun éifeachtacht aimpliúcháin níos fearr a chinntiú.
4. Faisnéis chomparáide Seicheamh Soinneáin, ní mór an spriocghéine a chur i gcomparáid sa bhanc géine chun aimpliú neamhshonrach a chosc.
5. Láithreacht pseudogenes.Is seicheamh DNA é pseudogene cosúil le gnáthghéine ach cailleann sé a gnáthfheidhm.Is minic a bhíonn sé i dteaghlach il-ghéine ewcaryotáití.Is gnách é a léiriú ag ψ.Is cóip DNA géanóm neamhfheidhmiúil é sa ghéanó atá an-chosúil leis an seicheamh géine códaithe., go ginearálta nach bhfuil tras-scríofa, agus nach bhfuil aon bhrí fiseolaíoch soiléir.
6. Suíomh na primers i gcomparáid le exons agus introns.Sna blianta tosaigh, nuair a bhí fadhb an éillithe DNA réitithe againn, ba mhinic a thugamar aird ar shuíomhanna na bpreamaithe, na n-easónacha agus na n-introns, agus go ginearálta rinneamar machnamh ar phriméirí a dhearadh trasna intron chun aimpliú DNA a sheachaint.Féach ar an bhfigiúr thíos le do thoil: seasann dubh introns, seasann gormacha éagsúla le heasóin, seasann bándearg do phriméirí coitianta, agus seasann dearg geal le primers intron-chréise.

Scéimreach, ní fíor riamh
Is cosúil gur plean foirfe é seo, ach go deimhin, i bhformhór na gcásanna, níl na primers tras-intron chomh draíochta agus a shamhlaítear, agus cuirfidh siad faoi deara aimpliú neamhshonrach freisin.Mar sin is é an bealach is fearr chun éilliú DNA a chosc ná DNA a bhaint go hiomlán.
7. Tuar Comhréireachta.Ag baint úsáide as an sampla seo arís, bain úsáid as an uirlis mFold ar líne chun struchtúr tánaisteach an bhlúire sprice a chinneadh ag teocht ar leith agus tiúchan salainn.

Struchtúr tánaisteach RNA ag teochtaí éagsúla
Is é an struchtúr tánaisteach péireáil chomhlántach an teimpléid féin, rud a fhágann go mbeidh iomaíocht láidir idir an primer agus an péireáil teimpléad, agus tá an seans go mbeidh an primer ceangailteach níos lú, rud a fhágann go mbeidh sraith fadhbanna mar E íseal agus droch-atrialltacht.Trí thuar bogearraí, mura bhfuil fadhb struchtúr tánaisteach ann, bheadh ​​​​sé sin iontach.Má tá, pléifidh ár n-alt leantach go sonrach conas an fhadhb seo a réiteach.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides

Maidir le PCR cainníochtúla fluaraiseacha, is é an chéad rud a bhfuil tú ag streachailt leis gach lá ná eastóscadh RNA, agus b'fhéidir gur dearadh primer an dara rud.
Ar an gcéad dul síos, déanaimid seiceáil fós ar na rialacha maidir le dearadh primer de réir seicliosta MIQE.Tá sé chomh simplí gur féidir leis na scumbags gáire a dhéanamh, agus is féidir linn é a chríochnú in aon abairt amháin: faigh amach seicheamh agus suíomh an probe primer agus an modh modhnuithe.Maidir leis an modh íonú primer, tá sintéis primer chomh saor faoi láthair, tá qPCR fiú le LEATHANACH agus os cionn modhanna íonú, agus níl faisnéis na hionstraime sintéise tábhachtach.Tá go leor daoine ag déanamh primers ar feadh na mblianta agus níl a fhios acu gurb é ABI3900 an sintéiseoir.
Maidir le prionsabail an dearadh primer, ní gá duit iad a mheabhrú de ghlanmheabhair, mar is féidir leis an chuid is mó de na bogearraí deartha primer nó na huirlisí ar líne aire a thabhairt do na fadhbanna seo (uirlis mholta ar líne primer3.ut.ee/), agus ní dhéantar 99.999% de dhearadh primer de láimh Féach, déanann an t-údar uaireanta na céadta primers a dhearadh in aghaidh an lae, má léann tú ceann ar cheann, éireoidh sé as.
Seiceáil na pointí seo a leanas tar éis na primers a dhearadh:
1. Dearadh primers gar don deireadh 3′: I gcás primers oligo dT a úsáid le haghaidh sintéise céad-snáithe cDNA, ag smaoineamh ar éifeachtúlacht trascríobh droim ar ais agus sláine RNA, ní mór na primers deartha a dhearadh gar don deireadh 3′ chun éifeachtacht aimplithe a fheabhsú .Bain úsáid as pictiúr lena mhíniú mar seo a leanas (níl aon bhealach chun é seo a thuiscint):

Cén fáth ar chóir primers a dhearadh gar don deireadh 3′, caithfidh nach bhfuil sé fíor
2. Luach TM: Tá an luach Tm ag 55-65 ° C (toisc go bhfuil an ghníomhaíocht exonuclease is airde ag 60 ° C), agus tá an t-ábhar GC ag 40% -60%.
3. BLAST: Chun aimpliú neamhshonrach ar an ngéanóm a sheachaint, ní mór Blast a úsáid le haghaidh fíorú forlíontach.

MIQE(7)—próiseas qPCR

1. trealamh qPCR
De réir riachtanais MIQE, ní mór dúinn cur síos soiléir a dhéanamh ar na coinníollacha imoibrithe iomlána san alt, lena n-áirítear cumraíocht an chórais imoibrithe PCR, cén trealamh a úsáidtear, cé hé an monaróir, cé chomh mór agus atá an córas imoibrithe, cibé an úsáidtear an modh lí nó an modh probe, socruithe cláir PCR.Is cinnte go bhfaighidh tiománaithe veteranacha amach, chomh fada agus a roghnaítear an trealamh, go bhfuil an fhaisnéis thuas socraithe go bunúsach.
Faoi láthair, is teicneolaíocht an-aibí é déantúsaíocht agus táirgeadh feisteáin PCR cainníochtúla fluaraiseacha.Chomh fada agus nach roghnaíonn tú monaróirí an-dona, níl an dóchúlacht go mbeidh fadhbanna ard, ach ba mhaith linn fós roinnt pointí a roinnt leat:
Einsím Taq te-túsaithe:Is í an chuid is tábhachtaí de PCR an einsím Taq te-tosaithe.Tá na heinsímí te-tosaithe ar an margadh roinnte go ginearálta ina dhá chineál, is é ceann amháin einsím te-tosaithe modhnaithe go ceimiceach (is féidir leat a shamhlú mar leabú paraifín), agus is é an ceann eile einsím te-tús le haghaidh modhnú antasubstainte (ceangailte antigen-antasubstainte).Is bealach luath é modhnú ceimiceach einsímí teo-thosaithe.Nuair a shroichtear teocht áirithe, scaoilfidh an einsím a ghníomhaíocht.Úsáideann an einsím tús-te modhnaithe antasubstaintí modhanna bitheolaíocha chun gníomhaíocht na heinsíme a bhlocáil.Nuair a shroichtear teocht áirithe, déanfar an antashubstaint a dhínádúrú agus a dhíghníomhú mar phróitéin, agus cuirfear an ghníomhaíocht einsím i bhfeidhm.

Mar sin féin, cad é an úsáid a bhaint as seo?Is é seo an cás, tá gníomhaíocht scaoileadh einsímí modhnaithe antasubstainte níos tapúla ná gníomhaíocht einsímí modhnaithe go ceimiceach, agus mar sin i dtéarmaí íogaireachta, tá buntáiste beag ag einsímí modhnaithe antasubstainte, ionas nach mbeidh aon einsímí modhnaithe ceimiceacha go bunúsach sna feisteáin ar an margadh.Má tá, ansin tá teicneolaíocht an mhonaróra seo fós i bhfostú i ré na mílaoise.
Tiúchan ian maignéisiam:Tá tiúchan ian maignéisiam an-tábhachtach san imoibriú PCR.Is féidir le tiúchan cuí ian maignéisiam scaoileadh gníomhaíochta einsím Taq a chur chun cinn.Má tá an tiúchan ró-íseal, laghdófar go mór an ghníomhaíocht einsím;má tá an tiúchan ró-ard, cuirfear feabhas ar an aimpliú neamh-shonrach einsím-catalyzed.Cuirfidh tiúchan na n-ian maignéisiam isteach freisin ar annealú primers, teocht leá an teimpléid agus táirgí PCR, rud a dhéanfaidh difear do tháirgeacht blúirí aimplithe.Go ginearálta rialaítear tiúchan na n-ian maignéisiam ag 25mM.Ar ndóigh, le haghaidh trealamh maith, ní mór tiúchan na n-ian maignéisiam a rialú go maith.Cuireann roinnt ceannaithe gníomhaire chelating ian maignéisiam leis an imoibrí, rud a fhéadfaidh éifeacht choigeartú uathoibríoch an tiúchan ian maignéisiam a bhaint amach.
Tiúchan lí fluaraiseacha:Gineann dath fluaraiseacha, arb é an SYBR Green a úsáideann muid de ghnáth, fluaraiseacht den chuid is mó trí cheangal a dhéanamh ar an mion-groove de DNA dúbailte-snáithe, toisc go bhfuil ceangal an ruaime le DNA snáithe dúbailte neamh-shonrach, is é sin le rá Chomh fada agus a chuirtear DNA dúbailte-snáithe in éineacht leis, is féidir le fluaraiseacht tarlú, mar sin primer-dimers agus teimpléid DNA beidh sé in éineacht le cúlra sa chóras chun comhartha a chruthú.
PS: Mar gheall ar a n-airíonna éadrom-íogair, déantar táirgí ar an margadh a phacáistiú go ginearálta i bhfeadáin lártheifeacha donn teimhneach (mar a thaispeántar sa phictiúr thíos).Mar sin féin, beidh sé seo teacht ar fhadhb.Tá sé deacair a fheiceáil an bhfuil an leacht sucked nuair a bhíonn sé ag sampláil.Maidir leis seo, is é Qingke go deimhin an ceann is éasca le húsáid (mar a thaispeántar sa phictiúr thíos), agus tá an feadán trédhearcach pacáistithe i mála stáin teimhneach.Ansin cuir isteach i mála stáin é, ag cur san áireamh an áisiúlacht chun solais agus sampláil a sheachaint.Caithfidh tú an uimhir cheart táirge a roghnú.Is saol sár-éifeachtach ó thaobh costais é TSE204, rud a chuireann fonn orm féar a chur.

Tá tiúchan an lí fluaraiseacha an-tábhachtach freisin.Má tá an tiúchan ró-íseal, ní rachaidh an cuar aimpliúcháin suas sa chéim níos déanaí agus níl sé foirfe;má tá an tiúchan ró-ard, beidh sé ina chúis le cur isteach torainn.Ós rud é go mbraitheann an PCR cainníochtúil fluaraiseacha go príomha ar an luach CT, mura ndéantar tiúchan an lí fluaraiseacha a choigeartú i gceart, is fearr an pointe íseal ná an pointe ard.Ar ndóigh, is fearr an tiúchan lí cuí.

ROX: Úsáidtear ruaimeanna ROX chun earráidí comhartha fluaraiseachta tobair go maith a cheartú.Éilíonn roinnt déantúsóirí ionstraimí calabrú, ach ní dhéanann daoine eile.Mar shampla, de ghnáth éilíonn úsáid ionstraim aimplithe PCR Real Time Thermo Fisher Scientific le calabrú, lena n-áirítear 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etc. Déanfaidh na treoracha trealamh ginearálta cur síos air.
Tá dath ROX i Measc qPCR Foregene freisin, atá áisiúil le húsáid i múnlaí éagsúla.

Fíor-ama PCR Kit-Taqman

Cóireáil lag bannaí hidrigine: Is ábhar réasúnta teicniúil é cóireáil bannaí hidrigine lag.Níor léigh aon rud lámhleabhair go leor feisteáin, ach níor luaigh aon duine acu an t-ábhar seo.Go deimhin, tá sé chomh tábhachtach.Braitheann an meascán de bhunanna go príomha ar neart bannaí hidrigine.Is gnáth-aimpliú iad bannaí láidre hidrigine, agus bíonn aimpliú neamhshonrach mar thoradh ar bhannaí lag hidrigine.Mura féidir bannaí hidrigine laga a dhíchur go maith, ní féidir aimpliú neamhshonrach a sheachaint.Laistigh de raon feidhme an údair, níor thug ach cúpla cuideachta an fhadhb seo faoi deara.Nuair a cheannaíonn tú an trealamh, féadfaidh tú tagairt a dhéanamh do cibé an ndearna tú machnamh ar réiteach maidir leis seo don trealamh is mian leat a roghnú.

Toirt imoibrithe: Úsáidtear an córas 20-50ul níos coitianta, agus is dócha go n-eascraíonn méideanna níos lú earráidí.Go ginearálta, molfaidh na treoracha trealamh úsáid méideanna imoibrithe PCR.Ná bí cliste agus bain úsáid as méideanna níos lú chun costais a shábháil.an sprioc de.Táthar tar éis an toirt a mhol na ceannaithe a thástáil, agus b'fhéidir nach féidir leo fadhb na n-earráidí de bharr toirteanna beaga a réiteach.
2. Uimhir monaróir agus alt an phláta feadán
Tá a fhios ag gach duine prionsabal na PCR cainníochtúla fluaraiseacha.Déantar bailiú fluaraiseachta go príomha trí chaipíní feadán PCR.Agus tú ag roghnú earraí inchaite PCR, tabhair aird ar dhá phointe: tarchur solais maith agus oiriúnach don ionstraim.Go ginearálta, tá boird agus feadáin na mbrandaí príomhshrutha fíneáil, ach caithfidh tú a roghnú go cúramach i dtéarmaí oiriúnú, ar shlí eile ní bheidh tú in ann an ionstraim a úsáid.

4. Eolas barrleibhéil

MIQE (8) — bailíochtú qPCR
Is é seo an tosaíocht is mó de qPCR!Tá an oiread sin laochra tar éis titim isteach sa ghaineamh anseo.Ar ndóigh, is féidir freisin go bhfuil an t-ádh ort agus go bhfuil na géinte a ndearna tú staidéar orthu simplí, agus mar sin shnámh tú tríd an uaimh oighir ar feadh na gaoithe.Tá an fhaisnéis fíoraithe de qPCR ceaptha chun iontaofacht na sonraí a thástáil.Liostaímid an fhaisnéis fíoraithe riachtanach mar seo a leanas:

Tástáil 1.Specificity
Déantar sainiúlacht an aimplithe géine sprice a thástáil trína sheiceáil an bhfuil an pictiúr leictreafóiréis ina bhanna aonair;fíorú seicheamhaithe;cuar leá féachaint an bhfuil an léarscáil buaic singil;fíorú díleá einsímí agus modhanna eile.
Anseo, dírímid ar tanailís ar aimpliú neamhshonrach ag baint úsáide as an modh chun cuair leá.Go ginearálta, agus primers á ndearadh againn, ní mór méid na blúire táirge a bheith sa raon 80-200bp, rud a fhágann go bhfuil teocht leá an táirge PCR raon 80-85 ° C.Dá bhrí sin, má tá beanna ilghnéitheacha ann, ní mór go mbeadh táirgí aimpliúcháin neamhshonracha eile ann;má tá an chuma ar an mbuaic faoi bhun 80 °C, meastar go ginearálta gur dimer primer é;má fheictear an bhuaic os cionn 85 ° C, meastar go ginearálta gur éilliú DNA nó aimpliú neamhshonrach ar blúirí móra é.
Nóta: Uaireanta ní bhíonn ach buaic amháin ag 80°C.Ag an am seo, ní mór cloí leis an gcoincheap seo.Is dócha go bhfuil na torthaí aimplithe go léir primer dimers.

Gnáthchuar leá (buaic amháin gan aon aimpliú neamhshonrach)

Cuar leá fadhbach (aimpliú neamhshonrach ar bhuaiceanna spréite)
【Anailís cáis】

Tá príomh-bhuaic ann, ach tá an dimer primer tromchúiseach
Is féidir leis an gcuar leá aon-bhuaic sa fhigiúr thíos do shúile a mhealladh go héasca, ag smaoineamh gur turgnamh foirfe é, ach tá an toradh go hiomlán mícheart.Ag an am seo, ní mór dúinn breathnú ar an teocht leá.Tá an bhuaic-teocht faoi bhun 80°C, atá go hiomlán primer-dimer.

Uimh blúire sprice, gach dimers primer
Anseo, ní féidir le mo dheartháir stopadh.Sa phictiúr thíos tá grianghraf a tógadh le fón póca a sheol scumbag chugam.Is brandaí a úsáidtear go coitianta sa tionscal iad na himoibrithe a d'úsáid sé.D'athraigh sé ó bhranda T-réimír amháin go branda T-prefix eile.Sílim go bhfuil tú buille faoi thuairim cheana féin é.Ghlaoigh an scumbag orm: “Tá an t-imoibrí a úsáidtear sa chéad phictiúr ró-mhaith, agus tá an bhuaic singil.Níos déanaí, tar éis an t-imoibrí a mhol tú a úsáid, bíonn sé cosúil leis an dara pictiúr, le beanna measctha.Rinne tú trua dom.“
Scar an dá ghraf.Ar an gcéad amharc, tá buaic amháin ag ceann amháin, agus tá buaic dhúbailte ag an gceann eile.Nonsense, ar ndóigh is breá buaic amháin.An bhfuil sé sin fíor?
Níos measa ná Dou E, má chuirim an dá phictiúr sa phictiúr thíos, tuigfidh tú láithreach.Go deimhin, táimid pairilis go héasca ag an gcineál seo pictiúr.Tar éis anailís chúramach a dhéanamh, fuaireamar an méid seo a leanas amach: tá buaic an chéad fhigiúr ag 75 ° C, atá go hiomlán primer dimer;dealraitheach buaic an dara figiúr ag 75 ° C agus 82 ° C, ar a laghad tá an chuma ar an táirge.

Pictiúir d’aiseolas ó mhic léinn
Mar sin ní fadhb na n-imoibrithe í an fhadhb bhunúsach, ach fadhb an dearadh primer.Ag an am céanna, cruthaíonn sé freisin nach bhfuil roinnt brandaí móra ar chaighdeán iarainn, agus cruthaíonn sé freisin an méid a dúirt mo dheartháir roimhe seo: Ní hé an branda imoibrí a thacaíonn le d'alt.Is é d'alt a thacaigh le branda na n-imoibrithe.Just a shamhlú, mura n-athraigh an scumbag na himoibrithe, chuirfí na sonraí mícheart chuig an iris, agus ba thragóid é an rud a tharlódh.
2. Ct luach rialaithe bán
Ná mínigh, má tá luach Ct ag an rialú bán, nach truailliú é?Mar sin féin, ní mór duit a thuiscint fós cén rialú bán a bhfuil luach Ct aige.Más NTC é, ciallaíonn sé go bhfuil DNA eachtrach ann mar éilliú imoibrí.Más NRT é, ciallaíonn sé go bhfuil éilliú DNA ag an RNA asbhainte.
3. Cuar caighdeánach
Lena n-áirítear an fhoirmle fána agus ríomh, is féidir an éifeachtacht PCR a ríomh tríd an bhfoirmle.Chun turgnamh foirfe a dhéanamh, caithfidh fána an chuar chaighdeánaigh druidim le 3.32, agus R² druidim le 0.9999.
4. Raon dinimiciúil líneach
Tá raon dinimiciúil an imoibrithe líneach.De réir an teimpléid a úsáidtear chun an cuar caighdeánach a ghiniúint, ba cheart go n-áireofaí sa raon dinimiciúil 5 grádán tiúchana ar a laghad, agus aird a thabhairt ar athrú luachanna Ct ag grádáin tiúchan ard agus grádáin tiúchan íseal.
5. Cruinneas braite
Tá go leor fachtóirí mar gheall ar athruithe ar thorthaí qPCR, is é sin, droch-atrialltacht, is é sin, cruinneas bocht, lena n-áirítear teocht, tiúchan, agus oibriú.De ghnáth ní bhíonn an beachtas qPCR chomh inrialaithe de réir mar a thagann laghdú ar líon na gcóipeanna.Go hidéalach éagsúlacht laistigh den turgnamh, ba cheart go mbeadh an t-athrú teicniúil seo difriúil ó éagsúlacht bhitheolaíoch, agus is féidir le macasamhla bitheolaíocha aghaidh a thabhairt go díreach ar dhifríochtaí staitistiúla i dtorthaí qPCR idir grúpaí nó cóireálacha.Go háirithe maidir le measúnachtaí diagnóiseacha, ní mór an bheachtais idir-mheasúnaithe is fearr (in-atriallta) thar láithreáin agus oibreoirí a thuairisciú.
6. Éifeachtúlacht braite agus LOD (i ilphléacs qPCR)
Is é LOD an tiúchan is ísle de 95% de na samplaí dearfacha a braitheadh.I bhfocail eile, níor cheart go mbeadh an tiúchan LOD laistigh de thacar de mhacasamhlacha géine sprice níos mó ná 5% de na frithghníomhartha teipthe.Nuair a bhíonn anailís qPCR ilphléacs á déanamh, go háirithe le haghaidh sócháin pointe nó polymorphisms a bhrath go comhuaineach, ní mór do ilphléacs qPCR fianaise a sholáthar nach bhfuil cruinneas na blúirí sprice iolracha i gcontúirt san fheadán céanna, braite iolrach agus braite feadán aonair Ba chóir go mbeadh Éifeachtúlacht agus LOD mar an gcéanna.Go háirithe nuair a aimplítear spriocghéinte ard-tiúchana agus géinte sprice íseal-tiúchana ag an am céanna, ní mór aird a thabhairt ar an bhfadhb seo.
Fadhbanna agus réitighGo ginearálta, díríonn na fadhbanna a bhíonn go minic le linn dífhabhtaithe qPCR ar na gnéithe seo a leanas:
·aimpliú neamhshonrach
· Rogha deacair de thiúchan primer agus trioblóid le primer-dimers
·Tá an teocht annealing míchruinn
· Bíonn tionchar ag struchtúr tánaisteach ar éifeachtúlacht aimpliúcháin
aimpliú neamhshonrach
aimpliú neamhshonracha tharlaíonn, meastar go ginearálta nach bhfuil an dearadh primer oiriúnach, ach mura bhfuil deifir ort na primers a athrú, is féidir leat na modhanna seo a leanas a thriail ar dtús (tá an prionsabal ceangailte freisin):
·An teocht anáil a ardú – déan iarracht a dhéanamh nach féidir bannaí hidrigine laga a choinneáil;
·Giorrú a dhéanamh ar an am annealaithe agus fadaithe – laghdaigh an seans go mbeidh bannaí hidrigine lag;
·Tiúchan primer a laghdú – laghdaigh an seans go ndéanfar na primers as feidhm agus na réigiúin nach sprioc-réigiúin a cheangal;
Éifeachtúlacht aimpliúcháin íseal
A mhalairt ar fad atá ar aimpliú neamhshonrach – éifeachtacht íseal aimpliúcháin , agus na bearta chun déileáil le héifeachtúlacht íseal aimpliúcháin:
· An t-am annealing agus fadú a shíneadh;
· Athrú go PCR trí chéim agus an teocht annealing a laghdú;
· Méadú ar an tiúchan primer;
Ps: Níl go leor mac léinn iarchéime a rugadh sna 90í toilteanach staidéar a dhéanamh ar conas turgnaimh a dhífhabhtú, agus tá súil agam go bhféadfaidh an trealamh an fhadhb a réiteach go hiomlán (más mian leat dul chuig cuideachta imoibrí chun taighde agus forbairt a dhéanamh tar éis céime), go deimhin, is dóigh leis na monaróirí imoibrí ar an mbealach seo freisin, tá súil agam gur amadán é Is féidir é a úsáid nuair a fhaigheann tú é, agus mar sin tá go leor iarracht déanta ag monaróirí imoibrí chun an fhadhb a réiteach, go leor fadhbanna neamh-imoibrí a réiteach, lena n-áirítear cuid mhór de na fadhbanna a réiteach. fachtóirí orption.Chun an fhadhb a réiteach go héasca, caithfidh amaidí fós tabhairt isteach na cuideachta imoibrí a léamh chun féachaint an bhfuil fachtóir ann a ionsú bannaí hidrigine lag.
Rogha deacair de thiúchan primer agus trioblóid le primer-dimers
Modh 1: Go ginearálta, tá córais molta agus comhchruinnithe primer molta sna treoracha feiste do qPCR.
Modh 2: Dífhabhtaithe tríd an grádán tiúchana primer a shocrú.Goideadh an pictiúr thíos ó chuideachta lena léiriú.Taispeánann an figiúr thíos na torthaí cainníochtúla fluaraiseachta a rinneadh le trí ghrádán tiúchana primer (100nM, 250nM, 500nM) agus ceithre ghrádán tiúchana teimpléid (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Déantar luach Ct na dtorthaí turgnamhacha a bhreacadh mar seo a leanas:

Roghnú Tiúchan Príomhaire Comhdhlúthaigh gach tiúchan primer ina líne mar seo a leanas:

Tá an rogha tiúchan primer soiléir, is é an gaol líneach an tiúchan primer de 100nM agus 250nM níos fearr, agus tá caidreamh líneach an tiúchan primer de 500nM sách bocht.I 100nM agus 250nM, tá luach Ct 250nM sách beag, mar sin is é an tiúchan primer is fearr ná 250nM.Go ginearálta is féidir primer-dimers dian a fheiceáil sa chuar leá.Cad a tharlóidh mura féidir leis na primers deartha primer-dimers a sheachaint?
Modh 3: Laghdaigh méid na primers agus an teocht annealing a mhéadú (ní gá a mhíniú).
Is é 60°C luach eimpíreach na teochta annealaithe.Mura bhfuil tú cinnte, conas teocht annealing níos oiriúnaí a roghnú?Tá an freagra mar an gcéanna leis an rogha tiúchan primer -tástáil grádán.Glac pictiúr ón gcomhlacht Bio-rad chun an fhadhb a léiriú.Chun spriocbhlúire áirithe a aimpliú, socraigh ocht grádán teochta, gach ceann acu trí athrá, agus is é seo a leanas an cuar aimpliúcháin a fhaightear:

roghnú teochta annealing :
·70°C, 69°C – Go bunúsach, ní féidir na primers a chomhcheangal, mar sin níl aon aimpliú ann.
·67.3°C – Tá méid beag aimpliúcháin ag an tús, agus tá an luach Ct sách mór.
·64.5°C—— Laghdaíonn an luach Ct.
·Ag 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, agus 55.0°C, bhí na luachanna Ct cobhsaí go bunúsach, ach bhí na luachanna fluaraiseachta deiridh difriúil.
Conas a roghnú?Prionsabal: Is é an chéad phrionsabal an luach Ct níos airde.Maidir leis an luach Ct céanna, roghnaigh teocht annealing níos airde chun maolú agus aimpliú neamh-shonrach a sheachaint.Cé go bhfuil luach fluaraiseachta níos airde ag 55°C, d’fhéadfadh go mbeadh dimers nó aimpliú neamhshonrach ann.
Ach má tá tú chomh cliste leat, cinnteoidh tú: Ag labhairt go loighciúil, má tá an t-imoibriú PCR an-sonrach, chomh fada agus a sháraíonn an tiúchan primer an t-íosriachtanas, níor cheart go mbeadh aon éifeacht ag na pointí ard agus íseal, díreach cosúil le ruaimeanna fluaraiseacha agus dNTPs.Go deimhin, chomh fada agus a dhéantar an teocht annealing a uasmhéadú i gceart, íoslaghdófar go nádúrtha éifeacht tiúchan primer ar luach Ct.

Tá an teocht annealing optamaithe i gceart, agus íoslaghdófar éifeacht tiúchan primer ar CT
Bíonn tionchar ag struchtúr tánaisteach ar éifeachtúlacht aimpliúcháin
Glacaimis an pictiúr ó Bio-rad chun an fhadhb a léiriú.Dearann ​​sé freisin grádán teochta chun géine a aimpliú le struchtúr tánaisteach.

Tagann struchtúr tánaisteach chun cinn
Is féidir a fheiceáil, de réir mar a laghdaíonn an grádán teochta, go dtosaíonn táirgí ag láithriú agus go dtéann an luach Ct ar aghaidh, ag sroicheadh ​​an luach íosta ag 60.7 ° C, agus ansin de réir mar a laghdaíonn an grádán teochta, éiríonn an luach Ct níos mó.Os a choinne sin, de réir mar a mhéadaíonn an teocht, osclaíonn an struchtúr tánaisteach agus méadaíonn an éifeachtúlacht aimplithe.Tar éis teocht áirithe a bhaint amach, ní féidir leis an teocht a mhéadú an éifeachtúlacht aimplithe a fheabhsú.Toisc nach féidir na primers a chomhcheangal go cobhsaí ag an am seo.Dá bhrí sin,lorg an teocht leis an luach Ct is ísle, arb é an teocht is fearr chun an teimpléad struchtúr tánaisteach a aimpliú!Ar ndóigh, ní mór go mbeadh a fhios ag amaidí cliste más rud é nach bhfuil sé riachtanach, is fearr na primers a athrú agus an réigiún struchtúr tánaisteach a sheachaint.
5. Leibhéal iarratais
MIQE – Anailís ar Shonraí

Tá an anailís sonraí tugtha go príomha ag an ionstraim chainníochtúil PCR fluaraiseacha.San alt roimhe seo, tá go leor oibre anailíse sonraí déanta, mar an rialú bán, a míníodh i ndearadh an turgnaimh.Tá soiléiriú déanta ar na géinte tagartha inmheánacha, ar na huimhreacha athuair, etc., anseo mínímid go príomha cur i bhfeidhm qPCR.
Úsáidtear qPCR go forleathan, agus is iad fíorú turgnamhach agus diagnóis aigéad núicléach na cásanna is coitianta a úsáidtear.
cainníochtú iomlán
Tá gaol líneach ag logáil (tiúchan tosaigh) le líon na dtimthriallta.Is féidir cuar caighdeánach a tharraingt ó chaighdeán a bhfuil uimhir chóip tosaigh ar eolas aige, is é sin, is féidir caidreamh líneach an imoibrithe aimpliúcháin a fháil.De réir luach Ct an tsampla, is féidir an tiúchan sa sampla a ríomh.An méid teimpléid le cur san áireamh.

Modh Áirithe Cainníochtúil Iomlán
Ní mór cainníochtú iomlán a bheith bunaithe ar an gcuar caighdeánach.Chun cuar caighdeánach a dhéanamh, tá gá le caighdeán.De ghnáth, is é an caighdeán ná plasmid a fhaightear tríd an spriocghéine a chlónáil.Cén fáth gur plasmid é?Toisc gurb é DNA plasmid ciorclach an ceann is cobhsaí.Caolaigh an táirge caighdeánach i 5 go 6 grádán de réir an chóimheas dúbailt (caolú 10-huaire), agus aird a thabhairt ar an aonfhoirmeacht nuair a chaolaítear é.Lig don luach Ct titim idir 15-30.

Ullmhúchán caighdeánach
Ag an am céanna, ba cheart an sampla atá le tástáil a chaolú freisin dá réir sin (cuimhnigh an fachtóir caolaithe), agus ba cheart go dtitfeadh an luach Ct freisin idir 15-30.Cuirtear an táirge caighdeánach + an sampla atá le tástáil ar an meaisín le chéile.Tar éis an reáchtáil, rinneadh cuar caighdeánach leis an tsubstaint chaighdeánach, agus tugadh na samplaí atá le tástáil isteach sa chuar caighdeánach chun an tiúchan a ríomh.
Víreas Heipitíteas B Is cainníochtú iomlán tipiciúil é cainníochtú HBV víreas Heipitíteas B, ar féidir leis uimhir chóip an víris a ríomh i 1ml fola.
Cóipuimhir a ríomh
Tiúchan samplach le tástáil (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × fachtóir caolaithe
Meáchan móilíneach samplach = líon na mbonn × 324
Uimhir chóip an tsampla atá le tástáil (cóipeanna/ul) = tiúchan an tsampla atá le tástáil / meáchan móilíneach an tsampla × 6 × 1014

Modh ríofa na cóipuimhir

Is é an méid thuas an modh ríofa chun an chainníocht a chinneadh.Is fadhb matamaitice é seo is féidir a réiteach tar éis céim a bhaint amach ón ardscoil shóisearach, agus go ginearálta réitíonn ríomhairí fadhbanna matamaitice.Mura dtuigeann tú, is féidir leat teacht chun cumarsáid a dhéanamh.
cainníochtú coibhneasta
Úsáidtear cainníochtú coibhneasta go príomha i dtaighde eolaíoch.Cé mhéad víris atá ann i 1ml fola, agus is víreas DNA é, is imeacht sách cinntitheach é seo: is féidir méid na fola a chinneadh, agus tá an víreas DNA sách cobhsaí.Mar sin féin, tá sé deacair dúinn comparáid a dhéanamh idir líon na gcóipeanna trascríobh de ghéine áirithe i duilleog, toisc go bhfuil sé deacair méid, meáchan, agus tenderness na duille a chinneadh, tá sé deacair méid RNA a bhaintear a chinneadh, agus is deacair éifeachtacht trascríobh droim ar ais a chinneadh freisin , is é sin le rá, féadfaidh aon chéim a dhéanamh go bhfuil fabhtanna ag na sonraí turgnamhacha agus ní féidir iad a úsáid.
Mar sin, ní mór gné a thabhairt isteach le cainníochtú coibhneasta:an ghéin thagartha inmheánach .
I bhfocail eile, is comparáid idir an spriocghéine agus an ghéin thagartha inmheánach é cainníochtú coibhneasta.I gcomparáid leis an bhfíochán céanna agus an chill chéanna, tá tionchar méid an tsampla, méid eastóscadh RNA, éifeachtúlacht trascríobh droim ar ais, agus éifeachtacht PCR sách beag.Mar gheall ar mhéid an tsampla bhig, laghdaíodh géinte tagartha inmheánacha agus géinte sprice araon.Sin an fáth a bhfuilimid ag cur béime ar aonfhoirmeacht agus ar chobhsaíocht roimhe seo.
Tá géinte tagartha inmheánacha i gcoitinnegéinte coimeádta(géinte coimeádta), a thagraíonn d’aicme géinte a shloinntear go cobhsaí i ngach cill, agus a bhfuil a dtáirgí riachtanach chun bunghníomhaíochtaí beatha na gceall a chothabháil.
Ná cuir an coincheap seo amú.Is téarmaí feidhme bitheolaíocha iad géinte coimeád tí, agus is téarmaí teicniúla turgnamhacha iad géinte tagartha inmheánacha.Ní mór do ghéinte tís bailíochtú a dhéanamh sular féidir iad a roghnú mar ghéinte tagartha inmheánacha.
Mar shampla, roghnaigh muid roinnt géinte coimeádta san fhigiúr thíos chun a leibhéil slonn i gcealla fíocháin éagsúla a thástáil, agus fuair muid amach go raibh leibhéil slonn β-2-micreaglobulin an-difriúil ó na cinn de na trí ghéinte eile, agus mar sin níorbh fhéidir iad a úsáid mar ghéinte tagartha inmheánacha.

Tar éis tuiscint a fháil ar fheidhm cheartúcháin an ghéine tagartha inmheánaigh, díorthaítear dhá algartam mar gheall ar thabhairt isteach an ghéine tagartha inmheánaigh.
· modh cuar caighdeánach dúbailte
·2 – △△ Modh Ct (modh comparáide luach CT)
Má tá suim agat i staidéar a dhéanamh ar speicis agus feidhmeanna géine, le do thoil a thabhairt suas an taighde ar halgartaim agus foirmlí a úsáid go díreach, nó meaisíní a úsáid go díreach;más duine díreach tú sa mhatamaitic agus san innealtóireacht, bíodh leisce ort.
modh cuar caighdeánach dúbailte
Déan géine sprice agus géine tís an tsampla rialaithe agus an sampla atá le tástáil a chainníochtú tríd an gcuar caighdeánach, agus ansin ríomh an luach coibhneasta de réir na foirmle ríofa, is é sin an leibhéal slonn coibhneasta.
Buntáistí: anailís shimplí, leas iomlán a bhaint turgnamhach réasúnta simplí
Míbhuntáiste: I gcás gach géine, caithfidh gach babhta turgnaimh cuar caighdeánach a dhéanamh
Feidhmchlár: Ceann den dá mhodh cainníochtúla coibhneasta is coitianta a úsáidtear agus is aitheanta chun staidéar a dhéanamh ar rialáil slonn géine
Seo a leanas an fhoirmle:

Seo a leanas na samplaí:

Ríomh an méid coibhneasta bunaithe ar an toradh cainníochtúil
2 – △△ Modh Ct (modh comparáide luach CT)

Buntáistí: Ní gá cuar caighdeánach a dhéanamh
Míbhuntáistí: Glactar leis go bhfuil an éifeachtacht aimpliúcháin gar do 100%;tá an diall caighdeánach < 5%, agus glactar leis go bhfuil an cuar caighdeánach agus an éifeachtúlacht idir gach aimpliú comhsheasmhach;tá leas iomlán a bhaint as coinníollacha turgnamhacha níos casta.
Feidhmchlár: Ceann den dá mhodh cainníochtúla coibhneasta is coitianta a úsáidtear agus is aitheanta chun staidéar a dhéanamh ar rialáil slonn géine

Ar ndóigh, is gnách go bhfuil an éifeachtacht aimplithe dodhéanta go foirfe 1. Modh ceartúcháin: Má tá a fhios againn go bhfuil an éifeachtacht aimplithe céanna ag an spriocghéine agus ag an géine tagartha, ach nach bhfuil an éifeachtúlacht aimplithe comhionann le 1, ansin is féidir 2－△△Ct a cheartú mar: (1+E)－△△Ct, mar shampla, is féidir an fhoirmle 0.9 a cheartú, más féidir an fhoirmle 0.9 a cheartú. 5－△△Ct
Go dtí seo, tá an t-ábhar faoi PCR cainníochtúla fluaraiseacha tagtha chun críche .