Is eol go maith gurb é RNA an t-idirghabhálaí tras-scríbhinne idir DNA agus léiriú próitéine sa dogma lárnach.I gcomparáid le brath DNA, is féidir le braite RNA léiriú níos oibiachtúla a dhéanamh ar léiriú géine in orgánaigh.I measc na dturgnaimh a bhaineann le RNA tá: qRT-PCR, RNA-Seq, agus braite géine comhleá, etc. Bunaithe ar shaintréithe RNA féin (tá grúpa hiodrocsaile saor in aisce amháin ag fáinne siúcra RNA ná an fáinne siúcra DNA), in éineacht le líon mór RNases sa timpeallacht, tá RNA níos éagobhsaí agus níos éasca a bheith díghrádaithe ná DNA.Dramhaíl isteach, truflais amach, mura bhfuil cáilíocht an RNA go maith, ansin caithfidh na torthaí turgnamhacha a bheith míshásúil, léirithe go sonrach mar shonraí míchruinn nó droch-atrialltacht.Dá bhrí sin, ba cheart aird níos mó a thabhairt ar phróiseáil RNA, agus tá an nasc rialaithe cáilíochta níos tábhachtaí freisin chun cruinneas agus cruinneas na sonraí turgnamhacha ina dhiaidh sin a chinntiú.

Maidir le rialú cáilíochta RNA, tá na modhanna seo a leanas a úsáidtear go coitianta go ginearálta:

• Speictreafótaiméadracht
• leictreafóiréis glóthach agarose
• Bithanailíseoir Agilent
• PCR cainníochtúla fluaraiseacha fíor-ama
• Modh lí fluaraiseacha Qubit

01 Speictreafótaiméadracht

Tá bannaí dúbailte comhchuingeacha ag RNA agus tá buaic ionsúcháin aige ag tonnfhad 260nm.De réir dhlí Lambert-Beer, is féidir linn an tiúchan RNA a ríomh ón mbuaic ionsú ag 260nm.Ina theannta sin, is féidir linn íonacht RNA a ríomh freisin de réir an chóimheas idir buaiceanna ionsú 260nm, 280nm agus 230nm.Is iad 280nm agus 230nm na beanna ionsú próitéiní agus móilíní beaga, faoi seach.Ba cheart go mbeadh an cóimheas idir A260/A280 agus A260/A230 d’íonacht RNA cáilithe níos mó ná 2. Má tá sé níos lú ná 2, ciallaíonn sé go bhfuil éilliú próitéine nó móilín beag sa sampla RNA agus ní mór é a íonú arís.Cuirfidh foinsí éillithe isteach ar thurgnaimh iartheachtacha, mar shampla éifeachtúlacht aimplithe imoibrithe PCR a chosc, rud a fhágann go mbeidh torthaí cainníochtúla míchruinn ann.Tá tionchar mór ag íonacht RNA ar thorthaí ina dhiaidh sin, mar sin tá speictrophotiméadracht i gcoitinne mar nasc rialaithe cáilíochta fíor-riachtanach sa chéad chéim i dturgnaimh aigéid núicléacha.

Fíor 1. Gnáth-Speictream Ionsaithe RNA/DNA

02 Leictreafóiréis glóthach agarose

Chomh maith le íonacht, tá sláine RNA freisin ar cheann de na táscairí tábhachtacha chun cáilíocht RNA a mheas.Mar thoradh ar dhíghrádú RNA beidh líon mór blúirí gearra sa sampla, agus mar sin laghdófar líon na blúirí RNA is féidir a bhrath go héifeachtach agus a chumhdach leis an seicheamh tagartha.Is féidir sláine RNA a sheiceáil trí leictreafóiréis de RNA iomlán ar fhoirmiú agarose 1%.Is féidir leis an modh seo an glóthach a chumrú tú féin, nó an Córas E-Glóthach ™ réamhdhéanta a úsáid le haghaidh tástála sláine.Is RNA ribosómach é níos mó ná 80% den RNA iomlán, agus tá an chuid is mó de comhdhéanta de 28S agus 18S rRNA (i gcórais mhamach).Taispeánfaidh RNA dea-chaighdeán dhá bharra geal soiléire, arb iad barraí geala 28S agus 18S, faoi seach, ag 5 Kb agus 2 Kb, agus beidh an cóimheas gar do 2:1 de ghnáth.Má tá sé i stát idirleata, ciallaíonn sé go bhféadfadh an sampla RNA a bheith díghrádaithe, agus moltar an modh a thuairiscítear níos déanaí a úsáid chun cáilíocht RNA a thástáil tuilleadh.

Fíor 2. Comparáid idir RNA díghrádaithe (lána 2) agus RNA slán (lána 3) ar leictreafóiréis glóthach agarose

03 Bithanailíseoir Agilent

Chomh maith leis an modh leictreafóiréis glóthach agarose a thuairiscítear thuas, ar féidir leo cabhrú linn sláine RNA a aithint go simplí agus go tapa, is féidir linn bithanailíseoir Agilent a úsáid freisin chun sláine RNA a chinneadh.Úsáideann sé meascán de mhicreafluidics, leictreafóiréis ribeach, agus fluaraiseacht chun tiúchan agus sláine RNA a mheas.Trí úsáid a bhaint as an algartam ionsuite chun anailís a dhéanamh ar phróifíl an tsampla RNA, is féidir le bithanailíseoir Agilent luach sláine RNA tagartha, Uimhir Ionracas RNA (dá ngairfear RIN anseo feasta) a ríomh [1].Dá mhéad luach RIN, is airde sláine an RNA (tá 1 thar a bheith díghrádaithe, is é 10 an ceann is iomláine).Tugann roinnt turgnaimh a bhaineann le RNA le fios go n-úsáidfí RIN mar pharaiméadar do mheasúnú cáilíochta.Ag déanamh turgnaimh seicheamhaithe ard-tréchur (dá ngairtear NGS anseo feasta) mar shampla, i dtreoirlínte Repertoire Imdhíonachta Daonna Oncomine™, a úsáidtear chun gabhdóirí antaiginí cille B agus T a bhrath i sraith painéil Thermo Fisher's Oncomine, moltar samplaí le luachanna RIN níos mó ná 4, Léamh níos éifeachtaí agus is féidir clóin a thomhas (Fíor 3).Tá raonta éagsúla molta ann do phainéil éagsúla, agus go minic is féidir le RIN níos airde sonraí níos éifeachtaí a thabhairt.

Figiúr 3, i dturgnaimh Repertoire Imdhíonachta Daonna Oncomine™, is féidir le samplaí le RIN níos mó ná 4 léamha níos éifeachtaí agus clóin chill T a bhrath.【2】

Mar sin féin, tá roinnt teorainneacha ag an luach RIN freisin.Cé go bhfuil comhghaol ard ag RIN le cáilíocht sonraí turgnamhacha NGS, níl sé oiriúnach do shamplaí FFPE.Tá samplaí FFPE cóireáilte go ceimiceach ar feadh i bhfad, agus tá luach RIN réasúnta íseal ag an RNA a bhaintear go ginearálta.Mar sin féin, ní chiallaíonn sé seo go gcaithfidh sonraí éifeachtacha an turgnaimh a bheith míshásúil.Chun cáilíocht samplaí FFPE a mheas go cruinn, ní mór dúinn tomhais seachas RIN a úsáid.Chomh maith le RIN, is féidir le bithanalyzer Agilent luach DV200 a ríomh mar pharaiméadar meastóireachta ar cháilíocht RNA.Is paraiméadar é DV200 a ríomhann comhréir na blúirí níos mó ná 200 bp i sampla RNA.Is táscaire níos fearr é DV200 ar chaighdeán samplach FFPE ná RIN.Maidir leis an RNA a bhaintear as FFPE, tá comhghaol an-ard aige le líon na ngéinte is féidir a bhrath go héifeachtach agus éagsúlacht na ngéinte [3].Cé gur féidir le DV200 cúiteamh a dhéanamh ar na heasnaimh i mbrath cáilíochta FFPE, ní féidir le bithanailíseoir Agilent anailís chuimsitheach a dhéanamh fós ar na fadhbanna cáilíochta i samplaí RNA, lena n-áirítear an bhfuil coscairí sna samplaí.Is féidir le coscóirí iad féin tionchar a imirt ar éifeachtúlacht aimplithe na dturgnamh iartheachtacha agus an méid sonraí úsáideacha a laghdú.Chun a fháil amach an bhfuil inhibitor sa sampla, is féidir linn an modh PCR cainníochtúil fluaraiseachta fíor-ama a thuairiscítear seo chugainn a ghlacadh.

04 PCR cainníochtúla fluaraiseacha fíor-ama

Ní féidir leis an modh PCR cainníochtúil fluaraiseachta fíor-ama na coscairí sa sampla a bhrath, ach freisin cáilíocht RNA sa sampla FFPE a léiriú go cruinn.I gcomparáid le hanailíseoirí bitheolaíocha Agilent, tá níos mó tóir ar ionstraimí cainníochtúla fluaraiseachta fíor-ama i saotharlanna móra bitheolaíocha mar gheall ar a gcur i bhfeidhm níos leithne.Chun cáilíocht samplaí RNA a thástáil, ní gá dúinn ach taiscéalaithe primer a cheannach nó a ullmhú le haghaidh géinte tagartha inmheánacha, mar shampla GUSB (Cat uimh. Hs00939627).Trí úsáid a bhaint as an sraith primers, tóireadóirí agus caighdeáin seo (RNA iomlán de thiúchan aitheanta) chun turgnaimh chainníochtúla iomlána a dhéanamh, is féidir an tiúchan éifeachtach blúirí RNA a ríomh mar chaighdeán meastóireachta ar cháilíocht RNA (Cainníochtú Feidhmeach RNA (FRQ) go gearr).I dtástáil NGS, fuaireamar amach go bhfuil comhghaol an-ard idir FRQ na samplaí RNA agus an méid sonraí éifeachtach.I gcás na samplaí go léir atá os cionn 0.2ng/uL FRQ, is féidir le 70% ar a laghad de na léamha an seicheamh tagartha a chlúdach go héifeachtach (Fíor 4).

Fíor 4, tá comhghaolú an-ard (R2> 0.9) ag an luach FRQ a bhraitear leis an modh cainníochtúil fluaraiseachta leis na sonraí éifeachtacha a fuarthas sa turgnamh NGS.Is é an líne dhearg an luach FRQ cothrom le 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Chomh maith le bheith infheidhme maidir le samplaí FFPE, is féidir leis an modh PCR cainníochtúil fíor-ama monatóireacht éifeachtach a dhéanamh ar choscóirí i samplaí.Is féidir linn an sampla atá le brath a chur isteach sa chóras imoibrithe le Rialú Dearfach Inmheánach (IPC) agus a Mheasúnú, agus ansin cainníochtú fluaraiseachta a dhéanamh chun an luach Ct a fháil.Má tá an luach Ct taobh thiar den luach Ct san imoibriú gan sampla, léiríonn sé go bhfuil an t-inhibitor i láthair sa sampla agus cuireann sé bac ar éifeachtacht aimplithe san imoibriú.

05 Qubit modh lí fluaraiseacha

Is é Qubit Fluorometer an gléas beag is coitianta a úsáidtear le haghaidh tiúchan aigéad núicléach agus braite íonachta, atá éasca le feidhmiú agus atá ann i mbeagnach gach saotharlann bitheolaíochta mhóilíneach.Ríomhann sé tiúchan an aigéid núicléigh go cruinn trí lí fluaraiseacha atá ceangailteach le haigéad núicléasach (imoibrí braite Qubit) a bhrath agus a cheangal.Tá ardíogaireacht agus sainiúlacht ag Qubit, agus is féidir leis RNA a chainníochtú go cruinn síos go tiúchan pg/µL.Chomh maith leis an gcumas aitheanta tiúchan aigéid núicléacha a chainníochtú go cruinn, is féidir leis an tsamhail nua is déanaí de chuid Thermo Fisher, Qubit 4.0, sláine RNA a bhrath freisin.Aimsíonn córas braite RNA Qubit 4.0 (Measúnú RNA IQ) sláine RNA trí dhá ruaim fluaraiseacha ar leith a bhrath ag an am céanna.Is féidir leis an dá ruaim fluaraiseacha seo ceangal le blúirí móra agus le blúirí beaga RNA, faoi seach.Léiríonn an dá ruaim fluaraiseacha seo comhréir na blúirí móra RNA sa sampla, agus uaidh seo is féidir an luach IQ (Sláine agus Cáilíocht) a sheasann do cháilíocht RNA a ríomh.Tá an luach IQ infheidhme maidir le samplaí FFPE agus neamh-FFPE araon, agus tá tionchar mór aige ar cháilíocht seicheamhaithe ina dhiaidh sin.Ag glacadh le turgnaimh NGS mar shampla, sna turgnaimh tástála RNA-Seq a rinneadh ar an ardán Ion torrent™, bhí léamh éifeachtach 50% ar a laghad ag formhór na samplaí le luachanna IQ níos airde ná 4 (Fíor 5).I gcomparáid leis na modhanna braite thuasluaite, ní hamháin go bhfuil Qubit IQ Assay níos áisiúla oibriú agus tógann sé níos lú ama (laistigh de chúig nóiméad), ach tá comhghaol mór aige freisin idir luach paraiméadar tomhaiste IQ agus cáilíocht sonraí na dturgnaimh iartheachtacha.

Fíor 5, tá comhghaol mór idir luach Qubit RNA IQ agus na léamha mapáilte de RNA-Seq.【5】

Tríd an réamhrá thuas, creidim go bhfuil tuiscint leordhóthanach ag gach duine ar mhodhanna rialaithe cáilíochta RNA éagsúla.Go praiticiúil, is féidir leat a roghnúan modh comhfhreagrach de réir an chineáil sampla agus na n-ionstraimí atá ann cheana féin.Is trí cháilíocht RNA a rialú go maith amháin is féidir linn teip turgnaimh ina dhiaidh sin de bharr droch-chaighdeán an tsampla a sheachaint, rud a shábháil am luachmhar, fuinneamh agus costas.

Táirgí tagartha:

Trealamh Leithlisithe RNA Iomlán Ainmhithe

Kit Iomlán Leithlisiú RNA Cille

tagairtí

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.An RIN: uimhir sláine RNA chun luachanna sláine a shannadh do thomhais RNA.Biol Móilíneach BMC 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Treoir Úsáideora Repertoire Imdhíonachta Daonna Oncomine (Uimh. Teach Tábhairne MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Méadracht Feabhsaithe Cáilíochta chun RNA a Mheas a Dhíorthú As Samplaí Cartlainne Fíocháin Seasta Paraifín-Leabaithe Paraifín-Leabaithe, Eolaíochtaí Tocsaineolaíocha, Imleabhar 170, – Eagrán 3, Imleabhar 170, 3 Eagrán 3https://doi.org/10.1093/toxsci/