Cuimsíonn turgnamh RT-qPCR eastóscadh RNA agus measúnú cáilíochta, trascríobh droim ar ais agus qPCR trí chéim, tá go leor réamhchúraimí ag gach céim, tabharfaimid isteach go mion thíos.

Ⅰ.Measúnú cáilíochta RNA

I dturgnamh RT-qPCR, tar éis eastóscadh RNA a chríochnú, is gá cáilíocht RNA a mheas, agus ní féidir an turgnamh leantach a dhéanamh ach amháin tar éis dó a bheith cáilithe.I measc na modhanna meastóireachta tá speictreafótaiméadar, leictreafóiréis glóthach Agilent, anailís Agilent 2100, ina measc an speictreafótaiméadar is coitianta a úsáidtear agus modh leictreafóiréis glóthach agarose a bhrath.Ba chóir a thabhairt faoi deara gur gá an dá mhodh seo a úsáid le chéile chun tiúchan, íonacht agus sláine RNA a bhrath agus a anailísiú, ionas go gcinnteofar cáilíocht RNA.

Trealamh Leithlisithe RNA gaolmhar: 

Kit Iomlán Leithlisiú RNA Cille

Is féidir RNA iomlán ard-íonaithe agus ardchaighdeáin a fháil ó chealla saothraithe éagsúla i 11 nóiméad.

Trealamh Leithlisithe RNA Iomlán Ainmhithe

Baintear RNA iomlán ard-íonachta agus ardchaighdeáin go tapa agus go héifeachtach ó fhíocháin ainmhithe éagsúla.

Speictreafótaiméadar:

Úsáidtear an speictreafótaiméadar go príomha chun tiúchan agus íonacht RNA a chinneadh, ach ní féidir leis sláine RNA agus iarmhar genomic a bhrath.Ina measc, is paraiméadair thábhachtacha iad A260/280 agus A260/230 chun íonacht RNA a bhrath, agus is féidir íonacht RNA a bhrath de réir luaineacht a luachanna:

1. 1.9< A260/280< 2.1, rud a léiríonn go bhfuil íonacht RNA go maith;A260/280<1.9, rud a léiríonn go bhféadfadh iarmhar próitéine a bheith i RNA;A260/280>2.1, rud a léiríonn díghrádú páirteach féideartha RNA, ar féidir a dheimhniú tuilleadh le leictreafóiréis glóthach agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, rud a léiríonn go bhfuil íonacht RNA go maith;A260/230< 2.0, rud a thugann le fios go bhféadfadh iarmhair d’imoibrithe orgánacha a bheith in RNA, amhail feanóil, eatánól nó siúcraí.

Leictreafóiréis glóthach agarose:

Is féidir le measúnú leictreafóiréis glóthach agarose anailís a dhéanamh ar shláine RNA, géanóm agus iarmhair próitéin, ach ní féidir leis an tiúchan RNA a chainníochtú go cruinn ná iarmhair na n-imoibrithe orgánacha a bhrath.Tóg teimpléid RNA eukaryotic mar shampla:

1. Cuireadh an RNA faoi leictreafóiréis glóthach agarose.Mura raibh ach trí bhanda aonair de 28sRNA, 18sRNA agus 5.8sRNA ar an léarscáil glóthach, léiríonn sé go bhfuil an RNA a bhaintear slán.Má tá feiniméan tarraingthe ann, léiríonn sé díghrádú páirteach ar RNA.

2. Má tá banna geal amháin idir an poll gliú agus an banna 28sRNA, d'fhéadfadh go mbeadh iarmhar DNA genomic ann.

3. Má tá bannaí le feiceáil sa pholl gliú, léiríonn sé go bhféadfadh iarmhair próitéine agus substaintí macromolecular eile a bheith ann.

Ⅱ. Trascríobh droim ar ais

Tar éis eastóscadh RNA a bheith críochnaithe, ní mór é a aisiompú go cDNA le haghaidh turgnaimh ina dhiaidh sin, agus mar sin tá an chéim aisiompaithe riachtanach.Tabharfar isteach trascríobh droim ar ais ó roghnú an trascríobh droim ar ais agus primer:

Roghnú tras-scríbhinn droim ar ais:

Áirítear ar na tras-scríbhinní droim ar ais tipiciúil AMV RTase agus MMLV RTase.Tá gníomhaíocht láidir ag an RNase H de AMV RTase, fad sintéise gearr, méid sintéise íseal agus cobhsaíocht theirmeach maith (42 ~ 55 ℃).Tá gníomhaíocht RNase H de MMLV RTase lag, tá an fad sintéise fada, tá an méid sintéise ard, agus tá an cobhsaíocht theirmeach bocht (37 ~ 42 ℃).

Toisc go bhfuil feidhm ag einsím RNase H teimpléad RNA díghrádaithe, ba cheart go roghnófaí MMLV le gníomhaíocht RNase H lag go fabhrach le linn trascríobh droim ar ais, agus tar éis innealtóireacht ghéiniteach níos déanaí, tá léim cáilíochtúil bainte amach ag cobhsaíocht theirmeach MMLV.Ag tabhairt ForegeneForeasy Reverse Transcriptase(M-MLV le haghaidh trascríobh droim ar ais) mar shampla, is tras-scríbhinn nua droim ar ais é arna chur in iúl i mbaictéar a ndearnadh innealtóireacht orthu E. coli ag baint úsáide as teicneolaíocht athcheangail ghéiniteach.Is polaiméaráis DNA athchuingreach é a shintéisíonn snáithe DNA comhlántach ó RNA aonshnáithe, DNA, nó hibrideach RNA:DNA.Níl aon ghníomhaíocht RNase H aige, cobhsaíocht láidir, cleamhnas láidir RNA, agus íogaireacht bhrath ard.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(M-MLV le haghaidh trascríobh droim ar ais)

Roghnú primer:

Go ginearálta bíonn trí chatagóir ag primers RT: oligo dT, primers randamach, agus primers géine-shonracha.Roghnaigh primers oiriúnacha le húsáid de réir riachtanais turgnamhacha éagsúla.

1. Más de bhunús eucaryotic an teimpléad agus go n-úsáidtear an cDNA déanach le haghaidh gnáth-aimplithe PCR, moltar Oligo (dT);Mura n-úsáidtear an turgnamh ina dhiaidh sin ach le haghaidh qPCR, moltar Oligo (dT) a mheascadh le primers randamach chun éifeachtacht trascríobh droim ar ais a fheabhsú.

2. Más ó phrocaryotes atá an teimpléad, ba cheart Random Primer nó priméirí géine ar leith a roghnú le haghaidh tras-scríobh droim ar ais.

Ⅲ.qPCR

Déantar cainníochtú fluaraiseachta a mhionléiriú go príomha ó roghnú modhanna cainníochtúla, prionsabail dearaidh primer, roghnú ROX, cumraíocht an chórais imoibrithe agus socrú coinníollacha imoibrithe, etc.

Roghnú modhanna cainníochtúla:

Roinntear modhanna cainníochtúla i modhanna cainníochtúla coibhneasta agus modhanna cainníochtúla absalóideach.Is féidir cainníochtú coibhneasta a úsáid chun éifeacht modhanna cóireála áirithe ar léiriú géine a bhrath, difríocht léiriú géine a bhrath ag amanna éagsúla agus comparáid a dhéanamh idir difríocht léiriú géine i bhfíocháin éagsúla.Is féidir le cainníochtú iomlán méid an aigéid núicléigh sa víreas a bhrath agus mar sin de.Agus turgnaimh á ndéanamh againn, ní mór dúinn na modhanna cainníochtúla cuí a roghnú de réir ár dturgnaimh féin.

Prionsabail dearaidh primer:

Tá baint dhíreach ag dearadh primer le haghaidh qPCR le héifeachtúlacht aimplithe agus sainiúlacht an táirge.Dá bhrí sin, is é dearadh primers maith an chéad chéim de qPCR rathúil.I ndearadh primer, ba cheart aird a thabhairt ar na prionsabail seo a leanas agus prionsabal an dearadh traidisiúnta primer á gcomhlíonadh:

1. Tá fad an bhlúire sprice á rialú idir 100 agus 300 bp;

2. Dearadh tras-exon chun tionchar DNA genomic a sheachaint;

3. Ní mór na primers deartha a thástáil le haghaidh éifeachtacht aimpliúcháin, agus ní féidir ach amháin nuair a shroicheann an éifeachtacht aimpliúcháin an caighdeán (90-110%) iad a úsáid le haghaidh turgnaimh chainníochtúla;

4. De ghnáth déantar tiúchan primer a uasmhéadú idir 0.1uM agus 1.0uM.

Roghnú naROX:

Sa phróiseas imoibrithe cainníochtúil, is féidir le ROX an difríocht cosán optúil, earráid phíobáin nó difríocht toirte de bharr galú agus comhdhlúthaithe a choigeartú go haonfhoirmeach, rud a fheabhsóidh atrialltacht na dtorthaí.Mar sin féin, ba chóir a thabhairt faoi deara go bhfuil baint ag roghnú ROX leis an ionstraim.Má tá an fheidhm ag an ionstraim qPCR an difríocht idir poill a cheartú go huathoibríoch, ní gá ROX a chur leis;ar shlí eile, ní mór dó ceartú ROX a chur leis.Ní mór do chomhpháirtithe beaga i gceannach imoibrithe a bheith de réir na hionstraime a úsáidtear chun an ROX ceart a roghnú, botúin níos déanaí a sheachaint.

Ullmhú córas imoibrithe:

Is fearr toirteanna imoibrithe 20ul agus 50ul.Ba cheart aird a thabhairt ar na nithe seo a leanas agus an córas á fhoirmiú:

1. Is gá an córas imoibrithe a ullmhú trí aeráil sa bhinse oibre ultra-ghlan, ddH nua₂Úsáidtear O do gach turgnamh;

2. Ní mór do gach turgnamh NTC a ullmhú chun a fhíorú an bhfuil truailliú sa chóras, agus ní mór do gach péire primers NTC a dhéanamh agus an córas á ullmhú;

3. Chun a bhrath an bhfuil iarmhar gDNA sa teimpléad RNA, is féidir NRT a ullmhú le haghaidh gach sampla lena bhrath;

4. Agus an córas á ullmhú, moltar 3 athrá theicniúla ar a laghad a dhéanamh le haghaidh sampla amháin;

5. Nuair a bhíonn an teimpléad cDNA, moltar 5-10 uair a chaolú chun éifeacht chosc na gcóras trascríobh droim ar ais ar thurgnamh qPCR a laghdú.Is fearr an chainníocht teimpléad a iniúchadh de réir grádán, ionas go dtiteann an luach CT idir 20-30;

6. Déan líon riachtanach na n-imoibrithe a chinneadh, méadú 5-10% ar bhonn líon na n-imoibrithe, agus ríomh an líon cumraíochta toirte;

7, tá an córas ullmhaithe ag baint úsáide as prionsabal an premix, a mheascadh tar éis lártheifneoiriú agus a chinntiú nach bhfuil aon boilgeoga;

8, Chomh fada agus is féidir ábhair inchaite tacaíochta a roghnú.

Kit RT-qPCR gaolmhar