Déantar RT-qPCR a fhorbairt ó ghnáththeicneolaíocht PCR.Cuireann sé ceimiceáin fluaraiseacha (ruaimeanna fluaraiseacha nó tóireadóirí fluaraiseacha) leis an gcóras imoibrithe PCR traidisiúnta, agus aimsíonn sé an próiseas annealaithe agus síneadh PCR i bhfíor-am de réir a meicníochtaí luminescent éagsúla.Úsáidtear athruithe comhartha fluaraiseacha sa mheán chun méid an athraithe táirge i ngach timthriall de PCR a ríomh.Faoi láthair, is iad na modhanna is coitianta modh datha fluaraiseacha agus modh taiscéalaithe.

Modh datha fluaraiseachta:
Ní astaíonn roinnt ruaimeanna fluaraiseacha, mar shampla SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., solas leo féin, ach astaíonn fluaraiseacht tar éis iad a cheangal le mion-groove dsDNA.Mar sin, ag tús an imoibrithe PCR, ní féidir leis an meaisín an comhartha fluaraiseacha a bhrath.Nuair a théann an t-imoibriú ar aghaidh go dtí an síneadh annealing (modh dhá chéim) nó céim síneadh (modh trí chéim), osclaítear na snáitheanna dúbailte ag an am seo, agus an polaiméaráis DNA nua Le linn sintéise snáithe, cuirtear móilíní fluaraiseacha le chéile sa mhion groove dsDNA agus scaoileann siad fluaraiseacht.De réir mar a mhéadaíonn líon na dtimthriallta PCR, comhcheanglaíonn ruaimeanna níos mó agus níos mó le dsDNA, agus feabhsaítear an comhartha fluaraiseacha go leanúnach freisin.Tóg SYBR Green Ⅰ mar shampla.
Modh taiscéalaithe:
Is é taiscéalaí Taqman an taiscéalaí hidrealaithe is coitianta a úsáidtear.Tá grúpa fluaraiseacha ag deireadh 5′ an taiscéalaíochta, FAM de ghnáth.Is seicheamh é an taiscéalaí féin a chomhlánaíonn an spriocghéine.Tá grúpa múchadh fluaraiseacha ag deireadh 3′ an fhluarafór.De réir phrionsabal an aistrithe fuinnimh athshondais fhluaraiseachta (aistriú fuinnimh athshondais Förster, FRET), nuair a bhíonn an grúpa fluaraiseachta tuairisceora (móilín fluaraiseachta deontóra) agus an grúpa fluaraiseachta múchadh (glacadóir móilín fluaraiseachta) Nuair a bhíonn forluí ar an speictream excitation agus an t-achar an-dlúth (7-10nm), is féidir leis an móilín fluaraiseachta deontóra excitation a ghlacadh agus an móilín deontóra fluaraiseachta a ghlacadh. Tá lagú.Dá bhrí sin, ag tús an imoibrithe PCR, nuair a bhíonn an probe saor agus slán sa chóras, ní scaoilfidh an grúpa fluaraiseachta tuairisceoirí fluaraiseacht.Nuair a bhíonn sé á anáil, ceanglaíonn an primer agus an taiscéalaí leis an teimpléad.Le linn na céime síneadh, déanann an polymerase slabhraí nua a shintéisiú go leanúnach.Tá gníomhaíocht exonuclease 5′-3′ ag DNA polymerase.Nuair a shroichfidh sé an taiscéalaí, déanfaidh an DNA polymerase an tóireadóir a hidrealú ón teimpléad, scarfaidh an grúpa fluaraiseachta tuairisceora ón ngrúpa fluaraiseacha quencher, agus scaoilfidh sé an comhartha fluaraiseachta.Ós rud é go bhfuil gaol duine le duine idir an taiscéalaí agus an teimpléad, is fearr an modh taiscéalaithe ná an modh ruaime i dtéarmaí cruinneas agus íogaireacht na tástála.

Fíor 1 Prionsabal qRT-PCR

Dearadh primer
Prionsabail:

Ba cheart na primers a dhearadh sa réigiún caomhnaithe den tsraith aigéid núicléasaigh agus go mbeadh sainiúlacht acu.

Is fearr seicheamh cDNA a úsáid, agus tá seicheamh mRNA inghlactha freisin.Mura bhfuil, faigh amach dearadh réigiún na ndlúthdhioscaí don seicheamh DNA.
Is é fad an táirge cainníochtúil fluaraiseacha 80-150bp, is é 300bp an ceann is faide, is é an fad primer go ginearálta idir 17-25 bonn, agus níor cheart go mbeadh an difríocht idir na primers in aghaidh an tsrutha agus anuas ró-mhór.

Tá an t-ábhar G+C idir 40% agus 60%, agus is é 45-55% an ceann is fearr.
Tá an luach TM idir 58-62 céim.
Déan iarracht dimers primer agus féin- dimers a sheachaint, (ná cuma níos mó ná 4 phéire de bhoinn chomhlántacha as a chéile) struchtúr hairpin, mura féidir é a sheachaint, déan ΔG <4.5kJ/mol* Mura féidir leat a chinntiú go bhfuil gDNA bainte le linn tras-scríobh droim ar ais Glan, is fearr primers an intron *3 ′/ GCC a dhearadh, ní féidir le deireadh saibhir AT / A, a bheith athraithe go leanúnach, ATC / Réigiúin 1 ′ / A, deireadh saibhir a sheachaint. -3) primers agus neamh-
sonrach B’fhearr go bhfuil homaleolaíocht na seicheamh ilchineálach aimplithe níos lú ná 70% nó tá 8 homeolaíocht bhonn chomhlántach aici.
Bunachar Sonraí:
Cuardach CottonFGD de réir eochairfhocail
Dearadh primer:
Dearadh primer IDT-qPCR

Fig2 IDT leathanach uirlisí dearadh primer ar líne

Taispeántas leathanach torthaí Fig3
Dearadh na primers lncRNA:
lncRNA:na céimeanna céanna le mRNA.
miRNA:Prionsabal an mhodha lúb gas: Ós rud é gur sraitheanna gearra de thart ar 23 nt iad na miRNAs go léir, ní féidir brath díreach PCR a dhéanamh, mar sin baintear úsáid as an uirlis seicheamh lúb gas.DNA aon-shnáithe de thart ar 50 nt is ea an seicheamh lúb gas, ar féidir leis struchtúr bioráin ghruaige a dhéanamh leis féin.3 'Is féidir an deireadh a dhearadh mar sheicheamh comhlántach leis an blúire páirteach miRNA, ansin is féidir an sprioc-miRNA a nascadh leis an seicheamh gas-lúb le linn trascríobh droim ar ais, agus is féidir leis an fad iomlán 70bp a bhaint amach, atá ag teacht le fad an táirge aimplithe arna chinneadh ag qPCR.Dearadh primer miRNA fuíll .
Brath a bhaineann go sonrach le aimpliú:
Bunachar sonraí soinneáin ar líne: Soinneáin CottonFGD de réir cosúlachta seichimh
Soinneáin áitiúil: Déan tagairt do Blast+ a úsáid chun soinneáin áitiúil a dhéanamh, is féidir le linux agus macOS bunachar sonraí áitiúil a bhunú go díreach, is féidir córas win10 a dhéanamh freisin tar éis ubuntu bash a shuiteáil.Cruthaigh bunachar sonraí áitiúil soinneáin agus pléascadh áitiúil;oscail ubuntu bash ar win10 .
Fógra: Is barra tetraploideacha iad cadás ardtalún agus cadás oileán mara, mar sin is minic go mbeidh dhá chluiche nó níos mó mar thoradh ar phléasc.San am atá caite, trí úsáid a bhaint as dlúthdhioscaí NAU mar bhunachar sonraí chun soinneáin a dhéanamh is dócha go bhfaighidh sé dhá ghéinte homalógacha nach bhfuil ach cúpla difríocht SNP acu.De ghnáth, ní féidir an dá ghéinte homalógacha a dheighilt le dearadh primer, mar sin caitear leo mar an gcéanna.Má tá indel soiléir ann, déantar an primer a dhearadh ar an indel de ghnáth, ach d'fhéadfadh sé seo a bheith mar thoradh ar struchtúr tánaisteach an primer Éiríonn an fuinneamh saor in aisce níos airde, rud a fhágann go laghdaítear éifeachtacht aimpliúcháin, ach níl sé seo dosheachanta.

Struchtúr tánaisteach primer a bhrath:
Céimeanna:oscailte oligo 7 → seicheamh teimpléad ionchuir → fo-fhuinneog a dhúnadh → sábháil → aimsigh primer ar an teimpléad, brúigh ctrl+D chun fad an primer a shocrú → anailís a dhéanamh ar struchtúir tánaisteacha éagsúla, mar shampla comhlacht féin-dimerization, heterodimer, hairpin, mismatch, etc.Tá toradh an primer tosaigh go maith, níl aon struchtúr dimer agus hairpin soiléir ann, níl aon bhunús comhlántach leanúnach, agus tá luach iomlán an fhuinnimh saor in aisce níos lú ná 4.5, agus léiríonn an primer ar ais go leanúnach Tá na 6 bhonn comhlántach, agus is é an fuinneamh saor in aisce ná 8.8;ina theannta sin, feictear dimer níos tromchúisí ag an deireadh 3′, agus feictear dimer de 4 bhonn as a chéile.Cé nach bhfuil an fuinneamh saor in aisce ard, is féidir leis an 3′ dimer Chl difear tromchúiseach a dhéanamh ar shainiúlacht aimpliúcháin agus ar éifeachtúlacht aimplithe.Ina theannta sin, is gá a sheiceáil le haghaidh bioráin gruaige, heterodimers, agus neamhréireanna.

Torthaí braite Fig3 oligo7
Brath éifeachtúlachta aimplithe:
Cuireann éifeachtúlacht aimplithe an imoibrithe PCR isteach go mór ar thorthaí PCR.Chomh maith leis sin i qRT-PCR, tá an éifeachtacht aimpliúcháin thar a bheith tábhachtach do na torthaí cainníochtúla.Bain substaintí, meaisíní agus prótacail eile sa mhaolán imoibrithe.Tá tionchar mór ag cáilíocht na primers freisin ar éifeachtacht aimplithe qRT-PCR.D'fhonn cruinneas na dtorthaí a áirithiú, ní mór don chainníochtú fluaraiseachta choibhneasta agus don chainníochtú fíorfhluaraiseachta araon éifeachtacht aimplithe na bpreamaithe a bhrath.Aithnítear go bhfuil an éifeachtacht aimplithe éifeachtach qRT-PCR idir 85% agus 115%.Tá dhá mhodh ann:
1. Modh cuar caighdeánach:
a.Measc cDNA
b.Caolú grádán
c.qPCR
d.Cothromóid aischéimniúcháin líneach chun an éifeachtúlacht aimpliúcháin a ríomh
2. LinRegPCR
Is clár é LinRegPCR chun anailís a dhéanamh ar Shonraí RT-PCR fíor-ama, ar a dtugtar freisin sonraí cainníochtúla PCR (qPCR) bunaithe ar SYBR Green nó ceimic dá samhail.Úsáideann an clár sonraí ceartaithe neamh-bhonnlíne, déanann sé ceartú bonnlíne ar gach sampla Ar leithligh, socraíonn sé fuinneog na líneachta agus ansin úsáideann anailís aischéimniúcháin líneach chun líne dhíreach a chur isteach tríd an tacar sonraí PCR.Ó fhána na líne seo ríomhtar éifeachtacht PCR gach sampla aonair.Úsáidtear an mheánéifeachtúlacht PCR in aghaidh an aimplicain agus an luach Ct in aghaidh an tsampla chun tiúchan tosaigh in aghaidh an tsampla a ríomh, arna shloinneadh in aonaid fhluaraiseachta treallach.Déantar ionchur agus aschur sonraí trí scarbhileog Excel.Sampla amháin
tá gá le meascadh, gan aon ghrádán
céimeanna ag teastáil:(Tóg Bole CFX96 mar shampla, ní Meaisín go hiomlán le ABI soiléir)
turgnamh:is turgnamh caighdeánach qPCR é.
aschur sonraí qPCR:Is féidir le LinRegPCR dhá chineál comhaid aschuir a aithint: RDML nó toradh Aimpliúcháin cainníochtaithe.Go deimhin, is é luach braite fíor-ama an uimhir timthriall agus an comhartha fluaraiseachta ag an meaisín, agus déantar an t-aimpliú a fháil trí anailís a dhéanamh ar luach athraithe fluaraiseachta éifeachtacht na mírlíne líneach.
Roghnú sonraí: Go teoiriciúil, ba cheart go mbeadh an luach RDML inúsáidte.Meastar gurb í an fhadhb atá ag mo ríomhaire ná nach féidir leis na bogearraí RDML a aithint, agus mar sin tá an luach aschuir Excel agam mar na sonraí bunaidh.Moltar scagadh garbh a dhéanamh ar na sonraí ar dtús, mar shampla teip ar shamplaí a chur leis, etc. Is féidir na pointí a scriosadh sna sonraí aschuir (ar ndóigh, ní féidir leat iad a scriosadh, déanfaidh LinRegPCR neamhaird ar na pointí seo sa chéim níos déanaí)

Fig5 qPCR onnmhairiú sonraí

Fíor 6 roghnú samplaí iarrthóra

Ionchur sonraí:Torthaí aimplithe cáilíochta oscailte.xls, → oscail LinRegPCR → comhad → léigh ó excel → roghnaigh paraiméadair mar a thaispeántar i bhFíor 7 → Ceart go leor → cliceáil cinntigh bunlínte

Fig7 céimeanna ionchur sonraí linRegPCR

Toradh:Mura bhfuil aon athrá ann, ní gá grúpáil.Má tá athrá ann, is féidir an ghrúpáil a chur in eagar sa ghrúpáil samplach, agus ainm na géine a chur isteach san aitheantóir, agus ansin déanfar an ghéin chéanna a ghrúpáil go huathoibríoch.Ar deireadh, cliceáil ar an gcomhad, onnmhairiú excel, agus féach ar na torthaí.Taispeánfar éifeachtúlacht aimplithe agus torthaí R2 gach tobair.Ar an dara dul síos, má roinneann tú i ngrúpaí, taispeánfar an meánéifeachtúlacht aimplithe ceartaithe.A chinntiú go bhfuil éifeachtacht aimplithe gach primer idir 85% agus 115%.Má tá sé ró-mhór nó ró-bheag, ciallaíonn sé go bhfuil éifeachtacht aimplithe an primer bocht.

Fíor 8 Toradh agus aschur sonraí

Próiseas turgnamhach:
Riachtanais cháilíochta RNA:
íonacht:1.7Léiríonn 2.0 go bhféadfadh isothiocyanate iarmharach a bheith ann.Ba cheart go mbeadh aigéad núicléasach glan A260/A230 thart ar 2 . Má tá ionsú láidir ag 230 nm, léiríonn sé go bhfuil comhdhúile orgánacha cosúil le hiain feináit.Ina theannta sin, is féidir é a bhrath le leictreafóiréis glóthach agarose 1.5%.Cuir an marcóir in iúl, toisc nach bhfuil aon dínádúrú ag an ssRNA agus nach bhfuil gaol líneach ag an logarithm meáchan móilíneach, agus ní féidir an meáchan móilíneach a chur in iúl i gceart.Tiúchan: Teoiriciúilníníos lú ná 100ng/ul, má tá an tiúchan ró-íseal, is é an íonacht íseal go ginearálta nach bhfuil ard

Glóthach RNA Fig9

Ina theannta sin, má tá an sampla luachmhar agus an tiúchan RNA ard, moltar é a thabhairt slán tar éis eastóscadh, agus an RNA a chaolú go dtí tiúchan deiridh 100-300ng/ul le haghaidh tras-scríobh droim ar ais.Ian próiseas trascríobh droim ar ais, nuair a thrascríobhtar mRNA, úsáidtear primers oligo (dt) atá in ann ceangal sonrach a dhéanamh le heireabaill polyA le haghaidh tras-scríobh droim ar ais, agus úsáideann lncRNA agus circRNA primers heicseamair randamach (Randamach 6 mer) le haghaidh tras-scríobh iomlán RNA a aisiompú I gcás miRNA, úsáidtear primers lúb-mhuineál a bhaineann go sonrach le miRNA le haghaidh tras-scríobh droim ar ais.Tá feisteáin fuíll speisialta seolta ag go leor cuideachtaí anois.Maidir leis an modh lúb gas, tá an modh fuíll níos áisiúla, ard-thréchur, agus coigilte imoibrí, ach níor cheart go mbeadh an éifeacht a bhaineann le miRNAs den teaghlach céanna a idirdhealú chomh maith leis an modh lúb gas.Tá riachtanais ag gach feiste tras-scríofa droim ar ais maidir le comhchruinniú primers géine-shonracha (gas-lúb).Is é U6 an tagairt inmheánach a úsáidtear le haghaidh miRNA.Sa phróiseas inbhéartaithe gas-lúb, ba cheart feadán U6 a aisiompú ar leithligh, agus ba cheart na primers tosaigh agus cúl U6 a chur leis go díreach.Is féidir le circRNA agus lncRNA araon HKGanna a úsáid mar thagairt inmheánach.Ibraite cDNA,
mura bhfuil aon fhadhb ann le RNA, ba cheart go mbeadh cDNA breá freisin.Mar sin féin, má dhéantar foirfeacht an turgnaimh a shaothrú, is fearr géine tagartha inmheánach (géine tagartha, RG) a úsáid a fhéadfaidh gDNA a idirdhealú ó dhlúthdhioscaí.Go ginearálta, is géine coimeád tí é RG., HKG) mar a thaispeántar i bhFíor 10;Ag an am sin, bhí mé ag déanamh próitéin stórála pónaire soighe, agus d'úsáid mé actin7 ina raibh introns mar thagairt inmheánach.Ba é méid na blúire aimplithe den primer seo i gDNA ná 452bp, agus má úsáideadh cDNA mar theimpléad, ba é 142bp.Ansin fuarthas amach sna torthaí tástála go raibh cuid den cDNA truaillithe i ndáiríre ag gDNA, agus chruthaigh sé freisin nach raibh fadhb ar bith le toradh an trascríobh droim ar ais, agus d'fhéadfaí é a úsáid mar theimpléad le haghaidh PCR.Tá sé gan úsáid leictreafóiréis glóthach agarose a reáchtáil go díreach le cDNA, agus is banna idirleata é, nach bhfuil cinnte.

Fíor 10 braite cDNA

Coinníollacha qPCR a chinneadhgo ginearálta aon fhadhb de réir phrótacal an trealamh, go príomha sa chéim de luach tm.Mura bhfuil roinnt primers deartha go maith le linn dearadh primer, rud a fhágann go bhfuil difríocht mhór idir an luach tm agus an 60 ° C teoiriciúil, moltar an cDNA Tar éis na samplaí a mheascadh, PCR grádán a reáchtáil le primers, agus déan iarracht an teocht gan bannaí a shocrú mar luach TM a sheachaint.

Anailís sonraí

Tá an modh próiseála PCR cainníochtúil traidisiúnta fluaraiseachta coibhneasta go bunúsach de réir 2-ΔΔCT.Teimpléad próiseála sonraí.

Táirgí Gaolmhara:

Fíor-ama PCR Éasca^TM – Taqman

Fíor-ama PCR Éasca^TM –SYBR GLAS I

RT Easy I (Master Premix do shintéis cDNA den chéad snáithe)

RT Easy II(Master Premix do shintéis cDNA den chéad snáithe le haghaidh qPCR)