Sainiúlacht an bhrath
I bhformhór na gcásanna, is é cuspóir dearadh primer ná sainiúlacht PCR a uasmhéadú.Socraítear é seo ag an tionchar intuartha go leor athróg, níos mó nó níos lú.Athróg thábhachtach amháin is ea an seicheamh ag deireadh 3′an primer.
Rud atá tábhachtach, is dóichí go gcoimeádfaidh measúnuithe PCR atá deartha le haghaidh sainiúlacht ardéifeachtúlachta thar raon leathan dinimiciúil, toisc nach dtáirgtear táirgí aimpliúcháin neamhshonracha sa mheasúnacht, rud a fhágann go mbeidh sé in iomaíocht le himoibrithe PCR nó go gcuireann sé bac ar an bpríomhimoibriú aimpliúcháin.
Ar ndóigh, i gcásanna áirithe, níl sainiúlacht an ceann is tábhachtaí, mar shampla, nuair is é an sprioc ná pataiginí a bhaineann go dlúth a chainníochtú ach tá gá le caighdeáin speisialta deartha, leas iomlán a bhaint agus fíorú.
Is modh caighdeánach é an cuar leá chun sainiúlacht na n-aimpléad a mheasúnú, ar a laghad maidir le sprioc amháin a aimpliú.Mar sin féin, ní mór a aibhsiú gur féidir leis na cuair leá a bheith míthreorach mar, mar shampla, go bhféadfadh éifeachtaí comhcheangailte primers suboptimal agus tiúchan íseal teimpléid tionchar a bheith acu orthu.
P5 |Léiríonn an cuar leá na sealanna Tm a fhaightear ó dhá bhrath de mhéideanna difriúla de dhá sprioc-DNA.
A. Ag tiúchan níos airde (ad)), níl aon dimer primer soiléir tar éis an tomhas qPCR a chríochnú.De réir mar a laghdaíonn tiúchan an teimpléid go 50 cóip (e), tosaíonn táirge neamhshonrach le feiceáil agus is é an t-aon táirge amháin atá ag an tiúchan is ísle (f).
B. Taifeadadh na Tms céanna ag gach comhchruinniú sprice sa tástáil, agus ní raibh aon dimer primer soiléir fiú ag an tiúchan is ísle (5 chóip).Agus an dá mhodh braite seo á n-úsáid, níor aimsíodh aon táirgí aimpliúcháin i NTCanna.
Taispeánann P5 na cuair tuaslagtha a fuarthas le samplaí ina bhfuil an teimpléad i láthair ag tiúchana éagsúla.Léiríonn P 5a, ag an dá chomhchruinniú is ísle, go bhfuil Tms na dtáirgí aimpliúcháin neamhshonracha a tháirgtear níos ísle ná na táirgí aimpliúcháin ar leith.
Ar ndóigh, ní féidir an modh braite seo a úsáid go hiontaofa chun spriocanna atá ann i dtiúchan íseal a bhrath.
Is díol spéise é nár thaifead NTCanna, ie samplaí gan DNA ar bith, táirgí aimpliúcháin (neamhshonracha), rud a thugann le fios gur féidir le DNA géanómaíochta cúlra a bheith rannpháirteach in aimpliú/polaiméiriú neamhshonrach.
Uaireanta ní féidir primers cúlra agus aimpliú neamhshonrach den sórt sin a leigheas, ach is minic is féidir modh braite a dhearadh nach bhfuil aimpliú neamhshonrach aige in aon tiúchan teimpléid agus NTC (P 5b).
Anseo, fiú nuair a thaifeadtar aimpliú an sprioc-chomhchruinnithe le Cq de 35, beidh cuar díscaoilte sonrach ann.Mar an gcéanna, níor léirigh NTCanna aon chomharthaí d'aimpliú neamhshonrach.Uaireanta, d’fhéadfadh go mbeadh an t-iompar braite ag brath ar an deoch mháthair, agus ní aimsítear ach aimpliú neamh-shonrach i gcomhdhéanamh maolánach áirithe, a d’fhéadfadh a bheith bainteach le tiúchain éagsúla Mg2+.
Cobhsaíocht braite
Is céim úsáideach é leas iomlán a bhaint as Ta sa phróiseas fíoraithe eimpíreach agus leas iomlán a bhaint as braite qPCR.Soláthraíonn sé léiriú díreach ar stóinseacht an tsocraithe primer tríd an teocht (nó an raon teochta) a tháirgeann an Cq is ísle a thaispeáint gan an NTC a aimpliú.
B'fhéidir nach bhfuil an difríocht idir dhá agus ceithre huaire in íogaireacht tábhachtach do dhaoine a bhfuil léiriú mRNA ard acu, ach le haghaidh tástálacha diagnóiseacha, d'fhéadfadh go gciallódh sé an difríocht idir torthaí dearfacha agus bréagacha diúltacha.
Féadfaidh airíonna Ta na primers qPCR athrú go mór.Níl roinnt tástálacha an-láidir, agus mura ndéantar iad faoi luach optamach Ta na primers, beidh siad in olcas go tapa.
Tá sé seo tábhachtach toisc go mbíonn fadhbanna den chineál seo braite go minic sa saol fíor, agus b’fhéidir nach bhfuil íonacht an tsampla, tiúchan DNA, nó láithreacht DNA eile optamach.
Ina theannta sin, d'fhéadfadh an uimhir chóip sprice a bheith éagsúil i raon leathan, agus d'fhéadfadh na himoibrithe, uirlisí plaisteacha, nó ionstraimí a bheith difriúil ó na cinn a úsáidtear nuair a bhíonn an tástáil ar bun.
P6| Léiríonn an grádán teochta stóinseacht dhifriúil bhrath PCR.
A. Úsáid Mastermix Sensifast SYBR de chuid Bioline (uimhir chatalóg BIO-98050) chun PCR a dhéanamh ar cDNA ullmhaithe ó RNA inchinn an duine.
B. Bain úsáid as ionstraim CFX qPCR Bio-Rad chun léarscáil aimpliúcháin agus cuar díscaoilte apalene a thaifeadadh (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Graf aimpliúcháin agus cuar leá ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Graf aimpliúcháin agus cuar díscaoilte GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
Taifeadadh E. Cqanna ag teochtaí annealaithe éagsúla, ag taispeáint an difríocht i Cq a taifeadadh faoi ghrádán teochta 7C.
Léiríonn P 6 toradh tipiciúil ar thástáil neamh-inmhianaithe, áit a ndearnadh qPCR ag baint úsáide as grádán Tas idir 59C agus 67C (P 6a), ag baint úsáide as primers do thrí ghéinte inchinn-shonracha daonna.
Is féidir a fheiceáil ón ngraf aimpliúcháin go bhfuil primers Opalin i bhfad ó idéalach toisc go bhfuil a raon Ta optamach an-chúng (Fíor 6b), is é sin, go bhfuil Cqs scaipthe go forleathan, rud a fhágann go gcuirtear Cqs i gcomparáid go mór lena Cqs Íseal is fearr.
Tá an modh braite seo éagobhsaí agus d'fhéadfadh aimpliú suboptimal a bheith mar thoradh air.Dá bhrí sin, ba chóir an péire primers seo a athdhearadh.Ina theannta sin, léiríonn an anailís cuar leá (inset) go bhféadfadh fadhb a bheith ag sainiúlacht an mhodha braite seo freisin, toisc go bhfuil cuar leá gach Ta difriúil.
Tá an modh braite ACSBG1 a thaispeántar i P 6c níos láidre ná an modh braite Opalin thuas, ach tá sé fós i bhfad ó idéalach, agus is dócha gur féidir é a fheabhsú.
Mar sin féin, leagaimid béim nach bhfuil aon nasc riachtanach idir stóinseacht agus sainiúlacht, toisc go léiríonn an cuar díscaoilte a tháirgtear leis an modh braite seo an buaicluach céanna i ngach Tas (inset).
Ar an láimh eile, tá an tástáil stóinseachta i bhfad níos fulangaí, ag táirgeadh Cqanna comhchosúla i raon leathan TA, mar atá sa tástáil GFAP a thaispeántar i P 6d.
Tá an difríocht i Cqs a fhaightear sa raon céanna 8 céim Celsius níos lú ná 1, agus deimhníonn an cuar díscaoilte (insset) na saintréithe braite sa raon teochta seo.Is fiú a thabhairt faoi deara go bhféadfadh an raon Tas ríofa agus an raon Ta iarbhír a bheith an-difriúil.
Tá go leor treoirlínte ann atá deartha chun cabhrú le taighdeoirí priméirí éifeachtacha a dhearadh, a bhfuil an chuid is mó díobh bunaithe ar rialacha seanbhunaithe agus tá go leor airde tugtha do thríú deireadh na bpréimhéirí.Is minic a mholtar G nó C a áireamh ag an deireadh 3 'agus dhá bhonn G nó C (clamp GC), ach gan níos mó ná dhá cheann de na 5 bhonn deiridh.
Go praiticiúil, is féidir leis na rialacha seo taighdeoirí a threorú, ach ní gá go mbíonn siad ceart i ngach cás.
P7 |Is beag éifeacht atá ag deireadh 3′ an primer ar shainiúlacht ná ar éifeachtúlacht.
A. Suíomh na primers don ghéine daonna HIF-1α (NM_181054.2).
B. Úsáid Agilent Brilliant III SYBR Deochanna máthair Glas (Cat. Uimh. 600882) chun sé mhír tástála a mhéadú.
C. Graf aimpliúcháin agus cuar leá taifeadta ag ionstraim QPCR CFX Bio-Rad agus primers 3′deireadh.Taispeántar NTCanna i ndath dearg.
D. Taifead cqs de gach mír tástála
Mar shampla, tá an toradh i P 7 ag teacht salach ar an riail 3′deireadh.Táirgeann na dearaí go léir na torthaí céanna go bunúsach, agus níl ach dhá chomhcheangal primer as a dtagann aimpliú neamhshonrach in NTC.
Mar sin féin, ní féidir linn tacú le héifeacht na gearrthóg GC, mar sa chás seo, trí úsáid a bhaint as A nó T mar 30 bonn ar a mhéad, ní laghdaíonn sé an tsainiúlacht.
Taifeadadh Cqanna in NTCanna i dTástáil C, áit a gcríochnaíonn an F primer in GGCC, rud a léirigh go mb'fhéidir gur mhaith le duine na seichimh seo a sheachaint ag an deireadh 30.Cuirimid béim ar gurb é an t-aon bhealach chun an t-ord 3 'deireadh is fearr de phéire primer a chinneadh ná roinnt primers iarrthóirí a mheas go turgnamhach.
Éifeachtúlacht aimpliúcháin
Rud atá tábhachtach, cé nach féidir le braite PCR neamh-shonrach a bheith sainiúil riamh, is féidir an éifeachtúlacht aimplithe a choigeartú agus a uasmhéadú ar go leor bealaí éagsúla trí na coinníollacha einsím, deochanna máthar, breiseáin agus rothaíochta a athrú.
Chun éifeachtúlacht braite PCR a mheas, is fearr caolú sraitheach de 10 nó 5 huaire an sprioc-aigéad núicléach a úsáid, is é sin, an "modh cuar caighdeánach".
Má úsáidtear amplicons PCR nó spriocanna DNA sintéiseacha chun cuar caighdeánach a ghiniúint, ba cheart caolú sraitheach ar na spriocanna sin a mheascadh le méid leanúnach DNA cúlra (cosúil le DNA géanómach).
P8 |Cuar caolúcháin chun éifeachtacht PCR a mheas.
A. Úsáid primers le haghaidh HIF-1: F: AAGAACTTTTMGGCTCA agus R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC agus Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (uimhir chatalóg 600882) le haghaidh PCR agus coinníollacha cuar leá.
Trascríobhadh B. 100 ng RNA droim ar ais, caolaíodh é 2 uair, agus caolaíodh samplaí cDNA go sraitheach 5 huaire go dtí 1 ng DNA géanóm daonna.Taispeántar an cuar leá sa inset.
C. Rinneadh imoibriú RT, caolú, agus caolú sraitheach arís agus arís eile don dara sampla cDNA, agus bhí na torthaí cosúil.
Taispeánann P 8 dhá chuar caighdeánach, ag baint úsáide as an modh braite céanna ar dhá shampla cDNA éagsúla, is é an toradh an éifeachtúlacht chéanna, thart ar 100%, agus tá an luach R2 cosúil freisin, is é sin, an méid oiriúnachta idir na sonraí turgnamhacha agus an líne aischéimnithí nó na sonraí Leibhéal líneachta.
Tá an dá chuar caighdeánach inchomparáide, ach níl siad díreach mar a chéile.Más é an cuspóir an sprioc a chainníochtú go cruinn, ní mór a thabhairt faoi deara nach bhfuil sé inghlactha ríomh uimhir chóip a sholáthar gan an éiginnteacht a mhíniú.
P9 |Éiginnteacht tomhais a bhaineann le cainníochtú ag baint úsáide as cuar caighdeánach.
A. Úsáid primers do GAPDH (NM_002046) chun PCR agus coinníollacha cuar leá a chomhlíonadh.F: ACAGTTGCCTGTAGACC agus R: TAACTGGTTGAGCACAGG agus Mastermix Bioline's Sensifast SYBR (uimhir chatalóige BIO-98050).
B. Cairt aimpliúcháin, cuar leá agus cuar caighdeánach taifeadta le hionstraim QPCR CFX Bio-Rad.
C. Graf cuar caighdeánach agus eatramh muiníne 95% (CI).
D. An chóipuimhir agus an t-eatramh muiníne 95% de na trí luach Cq a dhíorthaítear ón gcuar caolúcháin.
Léiríonn P 9, le haghaidh tástála optamaithe, go bhfuil an inathraitheacht bhunúsach i gcuar caighdeánach aonair thart ar 2 uair (eatramh muiníne 95%, idir íosmhéid agus uasmhéid), agus b’fhéidir gurb í an inathraitheacht is lú is féidir a bheith ag súil leis.
Táirge gaolmhar:
Trealamh PCR Díreach Fíocháin Ainmhithe
Am postála: Meán Fómhair-30-2021
