Is teicneolaíocht chainníochtúil nua aigéid núicléacha é PCR cainníochtúil fhluaraiseachta (ar a dtugtar TaqMan PCR freisin, dá ngairtear FQ-PCR anseo feasta) a d'fhorbair PE (Perkin Elmer) sna Stáit Aontaithe i 1995. Tá an teicneolaíocht seo bunaithe ar PCR traidisiúnta trí tóireadóirí lipéadaithe fluaraiseacha a chur leis.I gcomparáid le PCR solúbtha, tá go leor buntáistí ag FQ-PCR chun a fheidhm chainníochtúil a bhaint amach.Tá sé beartaithe ag an Airteagal seo cur síos achomair ar shaintréithe, prionsabail, modhanna agus feidhmiú na teicneolaíochta.
1 Gnéithe
Ní hamháin go bhfuil íogaireacht ard PCR gnáth ag FQ-PCR, ach freisin mar gheall ar chur i bhfeidhm tóireadóirí fluaraiseacha, is féidir leis an athrú comhartha fluaraiseacha a bhrath go díreach le linn aimpliú PCR tríd an gcóras seolta fótaileictreach chun torthaí cainníochtúla a fháil, rud a sháraíonn go leor easnaimh de PCR traidisiúnta, agus mar sin tá sainiúlacht ard hibridiú DNA agus cruinneas ard na teicneolaíochta speictreascópachta aige freisin.
Mar shampla, ní mór táirgí PCR ginearálta a urramú trí leictreafóiréis glóthach agarose agus staining bróimíd ethidium le solas ultraivialait nó trí leictreafóiréis glóthach polyacrylamide agus staining airgid.Ní hamháin go n-éilíonn sé seo ilionstraimí, ach tógann sé am agus iarracht freisin.Na stains a úsáidtear Tá bróimíd ethidium díobhálach don chorp daonna, agus soláthraíonn na nósanna imeachta casta turgnamhacha seo deiseanna truaillithe agus dearfacha bréagacha.Mar sin féin, ní gá do FQ-PCR an clúdach a oscailt ach uair amháin le linn luchtú an tsampla, agus tá an próiseas ina dhiaidh sin oibríocht fheadáin dúnta go hiomlán, nach gá iar-phróiseáil PCR, ag seachaint go leor míbhuntáistí in oibríochtaí PCR traidisiúnta.Úsáideann an turgnamh go ginearálta an timthriallta teirmeach ABI7100 PCR arna fhorbairt ag cuideachta PE.
Tá na tréithe seo a leanas ag an ionstraim: ① Iarratas leathan: Is féidir é a úsáid le haghaidh cainníochtú táirge DNA agus RNA PCR, taighde léiriú géine, braite pataigin, agus leas iomlán a bhaint as coinníollacha PCR.② Prionsabal cainníochtúil uathúil: Ag baint úsáide as tóireadóirí lipéadaithe fluaraiseacha, carnfaidh an méid fluaraiseachta leis an timthriall PCR tar éis excitation léasair, ionas go mbainfear amach cuspóir an chainníochtúcháin.③ Ard-éifeachtúlacht oibre: Timthriallóir teirmeach 9600 PCR tógtha isteach, 1 go 2 uair an chloig faoi rialú ríomhaire chun aimpliú agus cainníochtú 96 sampla a chomhlánú go huathoibríoch agus go sioncrónach.④ Níl gá le leictreafóiréis glóthach: Ní gá an sampla a chaolú agus a leictreafóiréis, níl le déanamh ach taiscéalaí speisialta a úsáid chun a bhrath go díreach san fheadán imoibrithe.⑤Gan truailliú ar an bpíblíne: Glactar leis an bhfeadán imoibrithe uathúil atá faoi iamh go hiomlán agus an córas seolta fótaileictreach, mar sin ní gá a bheith buartha faoi thruailliú.⑥ Tá na torthaí in-atáirgthe: tá an raon dinimiciúil cainníochtúil suas le cúig ordú méide.Dá bhrí sin, ós rud é gur forbraíodh an teicneolaíocht seo go rathúil, tá meas ag go leor taighdeoirí eolaíocha air agus cuireadh i bhfeidhm i go leor réimsí é.
2 Prionsabail agus modhanna
Is é prionsabal oibre FQ-PCR ná an ghníomhaíocht exonuclease 5′→3′ den einsím Taq a úsáid chun taiscéalaí lipéadaithe fluaraiseachta a chur leis an gcóras imoibrithe PCR.Is féidir leis an tóireadóir hibridiú go sonrach leis an teimpléad DNA atá sa seicheamh primer.Tá deireadh 5′ an taiscéalaíochta lipéadaithe le géine astaíochta fluaraiseachta FAM (6-carboxyfluorescein, buaic astaíochta fhluaraiseachta ag 518nm), agus tá an deireadh 3′ lipéadaithe leis an ngrúpa múchadh fluaraiseachta TAMRA (6-carboxytetrabetramethylrhodamine), is é an buaic-astú fluaraiseachta ′ 25nm an probe astaíochta fluaraiseachta ′ 3 ′ an probe astaíochta fluaraiseachta ′ 25nm, buaic-astú an fhluaraiseachta. phoylated chun cosc a chur ar an tóireadóir a leathnú le linn aimpliú PCR.Nuair a fhanann an taiscéalaí slán, cuireann an grúpa múchta astú fluaraiseachta an ghrúpa astaithe faoi chois.Nuair a bhíonn an grúpa astaithe scartha ón ngrúpa múchadh, tá an cosc ardaithe, agus méadaíonn an dlús optúla ag 518nm agus é a bhrath ag an gcóras braite fluaraiseachta.Sa chéim athnáithithe, hibridíonn an taiscéalaí leis an teimpléad DNA, agus bogann an einsím Taq sa chéim síneadh feadh an teimpléad DNA leis an síneadh ar an primer.Nuair a ghearrtar an taiscéalaí, scaoiltear an éifeacht múchadh agus scaoiltear an comhartha fluaraiseacha.Gach uair a chóipeáiltear an teimpléad, gearrtar taiscéalaí, agus scaoiltear comhartha fluaraiseachta in éineacht leis.Ós rud é go bhfuil caidreamh aon-le-duine idir líon na fluorophóir a scaoiltear agus líon na dtáirgí PCR, is féidir an teicníc seo a úsáid chun an teimpléad a chainníochtú go cruinn.Úsáideann an ionstraim turgnamhach go ginearálta an timthriallta teirmeach ABI7100 PCR a d'fhorbair cuideachta PE, agus is féidir rothair teirmeacha eile a úsáid freisin.Má úsáidtear córas imoibrithe cineál imoibrithe ABI7700 don turgnamh, tar éis an t-imoibriú a chríochnú, is féidir na torthaí cainníochtúla a thabhairt go díreach trí anailís ríomhaire.Má úsáideann tú timthriallta teirmeacha eile, ní mór duit brathadóir fluaraiseachta a úsáid chun an comhartha fluaraiseachta san fheadán imoibriúcháin a thomhas ag an am céanna chun RQ+, RQ-, △RQ a ríomh.Is ionann RQ+ agus an cóimheas idir an déine luminescence sa ghrúpa astaíochta fluaraiseacha den fheadán samplach agus déine luminescence an ghrúpa múchadh, is ionann RQ- agus an cóimheas idir an dá cheann san fheadán bán, is ionann △RQ (△RQ=RQ=RQ+-RQ-) agus an méid athraithe comhartha fluaraiseachta le linn PCR. Tar éis próiseáil sonraí a fháil, is féidir torthaí cainníochtúla a fháilMar gheall ar thabhairt isteach tóireadóirí fluaraiseacha, tá feabhas suntasach ar shainiúlacht an turgnaimh.Ba cheart go gcomhlíonfadh dearadh an taiscéalaí na coinníollacha seo a leanas go ginearálta: ① Ba chóir go mbeadh fad an taiscéalaithe thart ar 20-40 bonn chun sainiúlacht an cheangail a chinntiú.② Tá ábhar na mbonn GC idir 40% agus 60% chun dúbailt seichimh núicléitíde aonair a sheachaint.③ Seachain hibridiú nó forluí le primers.④ Tá cobhsaíocht an cheangail idir an taiscéalaí agus an teimpléad níos mó ná cobhsaíocht an cheangail idir an primer agus an teimpléad, agus mar sin ba chóir go mbeadh luach Tm an taiscéalaí ar a laghad 5 ° C níos airde ná luach Tm an primer.Ina theannta sin, tá tionchar ag tiúchan an tóireadóir, an homaleolaíocht idir an tóireadóir agus an t-ord teimpléid, agus an fad idir an taiscéalaí agus an primer ar thorthaí an turgnaimh.
Táirgí gaolmhara:
An tSín Fíor-Ama PCR Monaróir agus Soláthraí Easyᵀᴹ-Taqman |Foregene (foreivd.com)
Am postála: Deireadh Fómhair-15-2021
