Bunús dearadh primer (is féidir fadhbanna 99% a réiteach)
1. Fad primer: Éilíonn an téacsleabhar 15-30bp, de ghnáth thart ar 20bp.Is fearr an coinníoll iarbhír a bheith 18-24bp chun an sainiúlacht a chinntiú, ach an níos faide, is fearr, laghdóidh primer ró-fhada an tsainiúlacht freisin, agus laghdóidh sé an toradh.
2. Réise aimpliúcháin primer: 200-500bp oiriúnach, agus is féidir an blúire a leathnú go 10kb faoi choinníollacha sonracha.
3. Bunús primer: Ba chóir go mbeadh ábhar G+C 40-60%, níl an éifeacht aimpliúcháin G+C ró-bheag go maith, is furasta bannaí neamhshonracha a bheith le feiceáil i bhfad ró-G+C.Is fearr ATGC a dháileadh go randamach, ag seachaint braislí de níos mó ná 5 núicléatídí purine nó pirimidín.Il-gc don deireadh 5′ agus seichimh idirmheánacha chun cobhsaíocht a mhéadú, GC saibhir ag an deireadh 3′ a sheachaint, gan GC do na 3 bhonn deiridh, nó gan GC ar feadh 3 de na 5 bhonn deiridh.
4. Seachain struchtúr tánaisteach i primers, agus seachain comhlánú idir dhá primers, go háirithe comhlánú ag an deireadh 3 ', ar shlí eile déanfar primer dimer a fhoirmiú agus ginfear bannaí aimplithe neamhshonracha.
5. Ba cheart na boinn ag deireadh 3 'na primers, go háirithe na boinn deiridh agus leathdhéanach, a phéireáil go docht chun teip PCR a sheachaint mar gheall ar bhoinn críochfoirt gan péireáilte.
6. Tá nó is féidir primer a chur leis le suíomhanna scoilteachta cuí, agus b'fhearr go mbeadh suíomhanna scoilteachta cuí ag an seicheamh sprice aimplithe, rud atá an-tairbheach le haghaidh anailíse scoilteachta nó clónáil mhóilíneach.
7. Sainiúlacht na primers: níor cheart go mbeadh aon homology soiléir ag primers le seichimh eile sa bhunachar sonraí seicheamh aigéad núicléasach.
8. Foghlaim conas bogearraí a úsáid: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Is fearr a oibríonn an dearadh ar líne seo).
Is féidir leis an ábhar thuas réiteach ar a laghad 99% de na fadhbanna dearadh primer.
Rialú sonraí dearadh primer
1. Fad primer
Tá fad primer ginearálta 18 ~ 30 bonn.Go ginearálta, is é an fachtóir is tábhachtaí a chinneann teocht annealing an primer fad an primer.Roghnaítear teocht annealing primer go ginearálta (luach Tm -5 ℃), agus úsáideann cuid acu luach Tm go díreach.Is féidir na foirmlí seo a leanas a úsáid chun teocht annealaithe na bpreiméirí a ríomh go garbh.
Nuair a bhíonn fad an primer níos lú ná 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Nuair a bhíonn fad an primer níos mó ná 20bp: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / fad-5 ℃
Ina theannta sin, is féidir go leor bogearraí a úsáid freisin chun an teocht annealing a ríomh, beidh an prionsabal ríomh difriúil, agus mar sin uaireanta d'fhéadfadh go mbeadh bearna beag ag an luach ríofa.Chun imoibrithe PCR a bharrfheabhsú, úsáidtear na primers is giorra a áirithíonn teocht anáil nach lú ná 54 ℃ ar mhaithe le héifeachtacht agus sainiúlacht is fearr.
Tríd is tríd, méadaítear sainiúlacht na primer faoi fhachtóir de cheathair do gach núicléitíd bhreise, ionas gurb é 18 núicléitíd an t-íosfhad primer don chuid is mó d'fheidhmchláir.Níl an teorainn uachtarach d'fhad primer an-tábhachtach, go príomha a bhaineann le héifeachtacht imoibrithe.Mar gheall ar eantrópachta, dá fhad a bheidh an primer, is amhlaidh is ísle an ráta ag a n-annealaíonn sé ceangal leis an sprioc-DNA chun teimpléad cobhsaí dúbailte-shnáithe a chruthú chun DNA polaiméireáis a cheangal.
Agus bogearraí á n-úsáid chun primers a dhearadh, is féidir fad na primers a chinneadh de réir luach TM ar a seal, go háirithe le haghaidh primers de PCR cainníochtúla fluaraiseachta, ba cheart TM = 60 ℃ nó mar sin a rialú.
Ábhar 2.GC
Go ginearálta, is é 40% ~ 60% ábhar G+C i sraitheanna primer, agus ba cheart ábhar GC agus luach Tm péire primer a chomhordú.Má tá claonadh tromchúiseach GC nó AT ag an primer, is féidir méid cuí eireaball A, T nó G agus C a chur le deireadh 5 'an primer.
3. Teocht annealing
Ba chóir go mbeadh an teocht annealing 5 ℃ níos ísle ná an teocht unchain.Má tá líon na mbonn primer beag, is féidir an teocht annealing a mhéadú go cuí, rud a d'fhéadfadh sainiúlacht PCR a mhéadú.Má tá líon na mbonn mór, is féidir an teocht annealing a laghdú go cuí.Ní dhéanfaidh an difríocht teochta annealing idir péire primers de 4 ℃ ~ 6 ℃ difear don toradh PCR, ach go hidéalach tá an teocht annealing de phéire primers mar an gcéanna, is féidir a bheith idir 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Seachain limistéar struchtúr tánaisteach an teimpléid aimpliúcháin
Is fearr réigiún struchtúr tánaisteach an teimpléid a sheachaint nuair a bhíonn an blúire aimplithe á roghnú.Is féidir le bogearraí ríomhaireachta ábhartha struchtúr tánaisteach cobhsaí an bhlúire sprice a thuar agus a mheas, rud atá cabhrach le haghaidh roghnú teimpléid.Léiríonn torthaí turgnamhacha gur minic nach n-éiríonn leis an leathnú nuair a bhíonn fuinneamh saor in aisce (△G) an réigiúin atá le leathnú níos lú ná 58.6lkJ/mol.
5. Éagothroime le DNA sprice
Nuair a bhíonn an sprioc-seicheamh DNA aimplithe mór, féadfaidh primer ceangal a dhéanamh le codanna iolracha den sprioc-DNA, agus mar thoradh air sin beidh bannaí iolracha le feiceáil sa toradh.An uair seo is gá úsáid a bhaint as tástáil bogearraí BLAST, suíomh Gréasáin:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Roghnaigh Ailínigh dhá sheicheamh (bl2seq).
Is féidir seichimh primer a ghreamú go crios 1 agus seichimh DNA spriocdhírithe go crios 2 a idirmhalartaithe, agus ríomhann BLAST féidearthachtaí comhlántacha, frith-fhéidearthachta agus eile, mar sin ní gá d'úsáideoirí a thabhairt faoi deara an slabhraí braite an dá slabhra.Is féidir leat an uimhir GI a chur isteach freisin má tá uimhir GI na seicheamh ar eolas agat sa bhunachar sonraí, mar sin ní gá duit cuid mhór den seicheamh a ghreamú.Ar deireadh, cliceáil Ailínigh ag 3 le feiceáil an bhfuil láithreáin homalógacha iolracha ag an primer sa sprioc DNA.
6. Teirminéal primer
Is é 3 'deireadh an primer an áit a dtosaíonn an síneadh, agus mar sin tá sé tábhachtach neamhréireanna a chosc ó tosú ansin.Níor cheart go mbeadh an foirceann 3 'níos mó ná 3 G nó C i ndiaidh a chéile, mar go gcruthóidh sé seo an primer trí dhearmad i réigiún seicheamh saibhrithe G+C.Ní féidir le foirceann 3 'aon struchtúr tánaisteach a dhéanamh, ach amháin i bhfrithghníomhartha speisialta PCR (AS-PCR), ní féidir deireadh 3′ an primer a chur ar neamhréir.Mar shampla, má tá an réigiún ionchódaithe aimplithe, níor cheart deireadh a chur le 3 'deireadh an primer ag an tríú suíomh codon, toisc go bhfuil seans maith go dtiocfaidh meath ar an tríú seasamh codon, rud a dhéanfaidh difear do shainiúlacht agus éifeachtacht an aimplithe.Agus primers iarscríbhinn á n-úsáid agat, féach ar an tábla úsáide codon, tabhair aird ar rogha bitheolaíochta, ná bain úsáid as primers iarscríbhinne ag an deireadh 3′, agus úsáid tiúchan níos airde de primers (1uM-3uM).
7. Struchtúr tánaisteach na primers
Níor cheart go mbeadh seichimh chomhlántacha ag na primers féin, ar shlí eile fillfidh na primers iad féin isteach i struchtúir hairpin, agus beidh tionchar ag an struchtúr tánaisteach seo ar cheangail primers agus teimpléid mar gheall ar bhac stéarach.Má úsáidtear breithiúnas saorga, níor cheart go mbeadh bunús comhlántach leanúnach na primers féin níos mó ná 3bp.Níor cheart go mbeadh aon chomhlántacht idir an dá primers, go háirithe ba cheart forluí comhlántach an 3 'deireadh a sheachaint chun cosc a chur ar fhoirmiú dimers primer.Go ginearálta, níor chóir go mbeadh níos mó ná 4 bhonn as a chéile homology nó comhlántacht idir péire de primers.
8. Cuir marcóirí nó loci leis
Is beag éifeacht atá ag deireadh 5 'ar shainiúlacht an aimpliúcháin agus mar sin is féidir é a mhodhnú gan difear a dhéanamh do shainiúlacht an aimpliúcháin.Áiríodh le modhnú primer 5 'deireadh: suíomh srianta einsíme a chur leis;Biotin lipéadaithe, fluaraiseacht, digoxin, Eu3+, etc. Tabhair isteach seichimh DNA ceangailteach próitéine;Suímh sóchán a thabhairt isteach, seichimh sóchán a chur isteach agus a bheith ar iarraidh agus seichimh tionscnóra a thabhairt isteach, etc. Beidh tionchar níos mó nó níos lú ag na boinn bhreise ar éifeachtúlacht an aimplithe agus méadóidh siad an seans go gcruthófar primer dimer, ach ní mór roinnt lamháltais a dhéanamh don chéad chéim eile.Is féidir seichimh bhreise nach bhfuil ar an seicheamh sprice, mar shuíomhanna srianta agus seichimh tionscnóra, a chur le foirceann 5′ an primer gan cur isteach ar shainiúlacht.Níl na seichimh seo san áireamh agus luachanna primer Tm á ríomh, ach ba cheart iad a thástáil le haghaidh comhlántacht agus struchtúr tánaisteach inmheánach.
9. Fochlónna
An chuid is mó den am, níl i gceist le PCR ach réamhchlónáil, agus ansin ní mór dúinn an sprioc-bhlúire a fhochlónáil i veicteoirí éagsúla, agus mar sin ní mór dúinn boinn bhreise a dhearadh don chéad oibríocht eile sa chéim PCR.
Tá achoimre thíos ar roinnt seichimh atá deartha le haghaidh fochlónáil.
Cuireadh suíomh srianta endonuclease srian
Is é suíomh srianta einsímí a chur leis an modh is coitianta a úsáidtear chun táirgí PCR a fhochlónáil.Go ginearálta, tá an suíomh scoilteachta sé bhonn, chomh maith leis an 5 'deireadh an suíomh scoilteachta gá a chur leis 2 ~ 3 bonn cosanta.Mar sin féin, tá líon na mbonn cosanta a theastaíonn ó einsímí éagsúla difriúil.Mar shampla, níl aon bhonn cosanta ag teastáil ó SalⅠ, éilíonn EcoRⅤ 1 bhonn cosanta, éilíonn NotⅠ 2 bhonn cosanta, agus éilíonn Hind Ⅲ 3 bhonn cosanta.
Cuireann LIC an t-eireaball leis
Is é ainm iomlán LIC ná Clónáil Ligation-Independent, modh clónála a chruthaigh Navogen go sonrach dá chuid den veicteoir pET.Tá foircinn ghreamaitheacha aon-shnáithe bonn 12-15 neamh-chomhlántacha ag an iompróir pET a ullmhaítear trí mhodh LIC, a chomhlánaíonn na foircinn ghreamaitheacha comhfhreagracha ar an blúire cuir isteach sprice.Chun críocha aimpliúcháin, ba cheart go gcomhlánódh seicheamh primer 5′ den chuid a cuireadh isteach an veicteoir LIC.Is féidir leis an ngníomhaíocht sheachtrach 3′→5′ de T4 DNA polymerase foirceann greamaitheach aonshnáithe a fhoirmiú ar an blúire ionsáite tar éis tamaill ghearr.Toisc nach féidir an táirge a fhoirmiú ach amháin ó annealing frithpháirteach an blúire cuir isteach ullmhaithe agus an veicteoir, tá an modh seo an-tapa agus éifeachtach, agus tá sé dírithe ar chlónáil.
Clón TA faoi stiúir cuir eireaball leis
Ní raibh clónáil TA in ann an blúire a dhíriú isteach i veicteoir, agus mar sin thug Invitrogen veicteoir isteach ina dhiaidh sin a d'fhéadfadh díriú ar chlónáil, ina raibh ceithre bhonn GTGGS feiceálach ag foirceann amháin.Mar sin, i ndearadh primers PCR, ba cheart seichimh chomhlántacha a chur leis dá réir sin, ionas gur féidir blúirí a “dhíriú”.
Mura bhfuil tú in am, is féidir leat sintéis dhíreach a thriail, ag comhcheangal na géine leis an veicteoir, agus is é sin a dtugaimid sintéis géine ET i matánaitheoirí.
D. Modh clónála In-Fusion
Níl gá le ligáis, níl aon imoibriú fada ag teastáil.Chomh fada agus a thugtar isteach seicheamh ag an dá cheann den veicteoir líneach I ndearadh na primers, ansin cuirtear an táirge PCR agus an veicteoir líneach isteach sa tuaslagán einsím in-chomhleá ina bhfuil BSA agus cuirtear iad ag teocht an tseomra ar feadh leathuaire, is féidir an claochlú a dhéanamh.Tá an modh seo oiriúnach go háirithe le haghaidh comhshó toirte mór.
10. Cumasc primer
Uaireanta, ní bhíonn ach eolas teoranta ar sheicheamh ar eolas faoi dhearadh primer.Mar shampla, mura bhfuil ach an t-ord aimínaigéad ar eolas, is féidir an primer cumaisc a dhearadh.Is meascán de sheichimh dhifriúla é primer cumaisc a léiríonn na bunfhéidearthachtaí éagsúla go léir a ionchódaíonn aimínaigéad amháin.Chun sainiúlacht a mhéadú, is féidir leat tagairt a dhéanamh don tábla úsáide codon chun an t-iarscríbhinn a laghdú de réir roghanna bonnúsáide orgánaigh éagsúla.Is féidir Hypoxanthine a phéireáil leis na bunanna go léir chun teocht annealing an primer a laghdú.Ná húsáid na boinn atá i gceangal leis ag deireadh 3′ an primer mar is leor anáil na 3 bhonn deiridh ag an deireadh 3′ chun PCR a thionscnamh ag an suíomh mícheart.Úsáidtear comhchruinnithe primer níos airde (1μM go 3μM) toisc nach bhfuil primers i go leor meascán comhcheangail sainiúil don teimpléad sprice.
amhábhair PCRsmacht
1. Cainníocht primer
Is é tiúchan gach primer ná 0.1 ~ 1umol nó 10 ~ 100pmol.Tá sé níos fearr a thabhairt ar aird ar an toradh is gá leis an méid is ísle de primer.Cuirfidh tiúchan ard primer faoi deara neamhréir agus aimpliú neamhshonrach, agus méadóidh sé an seans go gcruthófar dimers idir primers.
2. Tiúchan primer
Bíonn tionchar ag tiúchan na primers ar shainiúlacht.Is é an tiúchan primer is fearr go ginearálta idir 0.1 agus 0.5 μM.Mar thoradh ar thiúchan primer níos airde déantar táirgí neamhshonracha a aimpliú.
3. Teocht annealing an primer
Paraiméadar tábhachtach eile le haghaidh primers is ea an teocht leá (Tm).Is é seo an teocht nuair a léirítear 50% de na primers agus na seichimh chomhlántacha mar mhóilíní DNA dhá shnáithe.Tá gá le Tm chun teocht anáil PCR a shocrú.Go hidéalach, tá an teocht annealing íseal go leor chun a chinntiú go annealing éifeachtach na primers leis an seicheamh sprice, ach ard go leor chun laghdú nonspecific ceangailteach.Teocht annealing réasúnta ó 55 ℃ go 70 ℃.Go ginearálta tá an teocht annealing socraithe 5 ℃ níos ísle ná Tm de primer.
Tá roinnt foirmlí ann chun Tm a shocrú, a athraíonn go mór ag brath ar an bhfoirmle a úsáidtear agus ar sheicheamh na bpriméirí.Toisc go soláthraíonn an chuid is mó de na foirmlí luach Tm measta, níl sna teochtaí annealaithe go léir ach pointe tosaigh.Is féidir sainiúlacht a fheabhsú trí anailís a dhéanamh ar roinnt imoibrithe a ardaíonn an teocht anála de réir a chéile.Tosaigh faoi bhun an Tm-5 ℃ measta, agus méadú de réir a chéile ar an teocht annealing i incrimint de 2 ℃.Laghdóidh teocht annealing níos airde foirmiú dimers primer agus táirgí neamh-shonracha.Chun na torthaí is fearr a fháil, ba cheart go mbeadh neasluachanna Tm ag an dá primer.Má tá difríocht Tm na bpéirí primer níos mó ná 5 ℃, léireoidh na primers tús bréagach suntasach trí úsáid a bhaint as teocht annealing níos ísle sa timthriall.Má tá an dá primers Tm difriúil, socraigh an teocht annealing go 5 ℃ níos ísle ná an Tm is ísle.Mar mhalairt air sin, chun sainiúlacht a mhéadú, is féidir cúig thimthriall a dhéanamh ar dtús ag teochtaí annealaithe atá deartha le haghaidh Tm níos airde, agus na timthriallta eile ina dhiaidh sin ag teochtaí annealaithe atá deartha le haghaidh Tm níos ísle.Ligeann sé seo cóip pháirteach den teimpléad cinn scríbe a fháil faoi choinníollacha daingean.
4. Primer íonachta agus cobhsaíocht
Tá íonacht chaighdeánach na primers saincheaptha leordhóthanach don chuid is mó d'iarratais PCR.Is beag an bhaint de ghrúpaí benzoile agus isobutylyl trí dhíshalannú agus mar sin ní chuireann sé isteach ar PCR.Teastaíonn íonú ó roinnt feidhmchlár chun aon seichimh neamhiomlána sa phróiseas sintéise a bhaint.Tarlaíonn na seichimh teasctha seo toisc nach bhfuil éifeachtacht cheimic sintéise DNA 100%.Is próiseas ciorclach é seo a úsáideann imoibrithe ceimiceacha arís agus arís eile mar a chuirtear gach bonn leis chun DNA a dhéanamh ó 3′ go 5′.Is féidir leat a theipeann i gceachtar den dá thimthriall.Tá cuid mhór de sheichimh teasctha ag primers níos faide, go háirithe iad siúd atá níos mó ná 50 bonn, agus d'fhéadfadh go mbeadh gá le híonú.
Bíonn tionchar ag éifeachtacht na ceimice sintéiseacha agus an mhodh íonúcháin ar tháirgeacht na primers.Úsáideann cuideachtaí bithchógaisíochta, mar shampla Cíteolaíocht agus Shengong, aonad OD íosta chun aschur iomlán oligonucleoside a chinntiú.Seoltar primers saincheaptha i bhfoirm púdar tirim.Is fearr na primers a athdháileadh i TE ionas go mbeidh an tiúchan deiridh 100μM.Tá TE níos fearr ná uisce dí-ianaithe mar is minic a bhíonn pH an uisce aigéadach agus go n-éireoidh sé hidrealú oligonucleóisídí.
Braitheann cobhsaíocht primers ar choinníollacha stórála.Ba chóir púdar tirim agus primers tuaslagtha a stóráil ag -20 ℃.Is féidir primers tuaslagtha i TE ag tiúchan níos mó ná 10μM a stóráil go cobhsaí ag -20 ℃ ar feadh 6 mhí, ach ní féidir iad a stóráil ach amháin ag teocht an tseomra (15 ℃ go 30 ℃) ar feadh níos lú ná 1 seachtain.Is féidir primers púdar tirim a stóráil ag -20 C ar feadh 1 bhliain ar a laghad agus ag teocht an tseomra (15 C go 30 C) ar feadh suas le 2 mhí.
5. Einsímí agus a dtiúchan
Faoi láthair, is é an DNA Taq polymerase a úsáidtear go bunúsach ná an einsím innealtóireachta géine atá sintéiseithe ag baictéir coliform.Is é an méid einsím a theastaíonn chun imoibriú PCR tipiciúil a chatalú ná thart ar 2.5U (tagraíonn sé don toirt imoibrithe iomlán de 100ul).Má tá an tiúchan ró-ard, is féidir aimpliú neamh-shonrach a bheith mar thoradh air;má tá an tiúchan ró-íseal, laghdófar méid an táirge sintéiseach.
6. Cáilíocht agus tiúchan dNTP
Tá dlúthbhaint ag cáilíocht dNTP le tiúchan agus le héifeachtúlacht aimplithe PCR.Tá an púdar dNTP gráinneach, agus cailleann a athraitheacht a ghníomhaíocht bhitheolaíoch má tá sé stóráilte go míchuí.Tá tuaslagán dNTP aigéadach, agus ba chóir é a úsáid i dtiúchan ard, le tuaslagán maolánach 1M NaOH nó 1M Tris.HCL chun a PH a choigeartú go 7.0 ~ 7.5, méid beag fo-phacáistithe, stóráil reoite ag -20 ℃.Déanfaidh reo-leá iolrach díghrádú dNTP.I imoibriú PCR, ba chóir go mbeadh dNTP 50 ~ 200umol/L.Go háirithe, ba chóir aird a thabhairt ar thiúchan na gceithre DNTPS ba chóir a bheith comhionann (ullmhú caochÚn comhionann).Má tá tiúchan aon cheann acu difriúil ó na cinn eile (níos airde nó níos ísle), déanfar neamhréireanna.Laghdóidh tiúchan ró-íseal táirgeacht táirgí PCR.Is féidir le dNTP comhcheangal le Mg2+ agus an tiúchan de Mg2+ saor in aisce a laghdú.
7. Teimpléad (géine sprice) aigéad núicléasach
Tá méid agus céim íonú an teimpléid aigéid núicléigh ar cheann de na príomh-naisc maidir le rath nó teip PCR.Is gnách go n-úsáideann modhanna traidisiúnta íonú DNA SDS agus protease K chun eiseamail a díolama agus a dhiúscairt.Is iad príomhfheidhmeanna SDS ná: lipidí agus próitéiní a dhíscaoileadh ar an membrane cille, rud a scriosann an membrane cille trí phróitéiní membrane a thuaslagadh, agus próitéiní núicléacha a dhícheangal sa chill, is féidir SDS le chéile freisin le próitéiní agus deascán;Is féidir le Protease K próitéiní a hidrealú agus a dhíleá, go háirithe histones atá ceangailte le DNA, agus ansin feanól tuaslagóir orgánach agus clóraform a úsáid chun próitéiní agus comhpháirteanna cille eile a bhaint as, agus eatánól nó alcól iseapróipile a úsáid chun aigéad núicléach a deascadh.Is féidir an t-aigéad núicléach eastósctha a úsáid mar theimpléad le haghaidh imoibrithe PCR.Maidir le heiseamail braite cliniciúla ginearálta, is féidir modh tapa agus simplí a úsáid chun cealla a dhíscaoileadh, pataiginí a lysate, próitéiní a dhíleá agus a bhaint as crómasóim go dtí spriocghéinte saor in aisce, agus a úsáid go díreach le haghaidh aimpliú PCR.De ghnáth úsáideann eastóscadh teimpléad RNA modh isothiocyanate guanidine nó protease K chun RNase a chosc ó RNA díghrádaithe.
tiúchan 8.Mg2+
Tá éifeacht shuntasach ag Mg2+ ar shainiúlacht agus ar thoradh an aimplithe PCR.I imoibriú PCR ginearálta, nuair is é 200umol/L an tiúchan dNTP éagsúla, is é an tiúchan cuí Mg2+ ná 1.5 ~ 2.0mmol/L.Tá tiúchan Mg2+ ró-ard, laghdaítear sainiúlacht an imoibrithe, tarlaíonn aimpliú neamh-shonrach, laghdóidh tiúchan ró-íseal gníomhaíocht Taq DNA polymerase, rud a fhágann go laghdófar táirgí imoibrithe.
Bíonn tionchar ag hiain mhaignéisiam ar ghnéithe éagsúla de PCR, mar shampla gníomhaíocht DNA polymerase, a chuireann isteach ar tháirgeacht;Sampla eile is ea primer annealing, a chuireann isteach ar shainiúlacht.Nascann dNTP agus teimpléad le hian maignéisiam, ag laghdú an méid ian maignéisiam saor in aisce a theastaíonn le haghaidh gníomhaíochta einsíme.Athraíonn an tiúchan ian maignéisiam is fearr le haghaidh péirí agus teimpléid éagsúla primer, ach is é 1.5mM tiúchan tosaigh PCR tipiciúil le 200μM dNTP (nóta: Le haghaidh PCR cainníochtúil fíor-ama, bain úsáid as tuaslagán ian maignéisiam 3 go 5mM le taiscéalaí fluaraiseacha).Méadaíonn tiúchan níos airde d'ian maignéisiam saor in aisce an táirgeacht, ach freisin méadaíonn siad aimpliú neamhshonrach agus laghdaítear dílseacht.Chun an tiúchan is fearr a chinneadh, rinneadh toirtmheascadh ian maignéisiam in incrimintí de 0.5mM ó 1mM go 3mM.Chun an spleáchas ar leas iomlán a bhaint as ian maignéisiam a laghdú, is féidir polymerase Platinum Taq DNA a úsáid.Tá Platanam Taq DNA polymerase in ann feidhm a chothabháil thar raon níos leithne de thiúchan ian maignéisiam ná Taq DNA polymerase agus mar sin éilíonn sé níos lú leas iomlán a bhaint as.
9. Pcr-bhreiseáin a chur chun cinn
Is leor an leas iomlán a bhaint as teocht anáil, dearadh primer, agus tiúchan ian maignéisiam chun an chuid is mó de na teimpléid a aimpliú go sonrach;ach tá bearta breise ag teastáil ó roinnt teimpléid, lena n-áirítear iad siúd a bhfuil ard-ábhar GC iontu.Soláthraíonn breiseáin a chuireann isteach ar theocht leá DNA bealach eile chun sainiúlacht agus toradh an táirge a fheabhsú.Tá dínádúrú iomlán ar an teimpléad ag teastáil le haghaidh na dtorthaí is fearr.
Ina theannta sin, cuireann an struchtúr tánaisteach cosc ar primer ceangailteach agus síneadh einsím.
Cuireann breiseáin PCR, lena n-áirítear formamide, DMSO, glycerin, betaine, agus PCRx Enhancer Solution, feabhas ar aimpliú.Is é an mheicníocht a d'fhéadfadh a bheith acu ná an teocht leá a laghdú, rud a chabhraíonn le hannealú primers agus cuidiú le síneadh DNA polymerase tríd an réigiún struchtúir thánaisteach.Tá buntáistí eile ag Réiteach PCRx.Tá gá le leas iomlán a bhaint as ian maignéisiam íosta nuair a úsáidtear é le polymerase Platinum Taq DNA agus Platinum Pfx DNA polymerase.Mar sin, cuirtear an teicníc Platanam in éineacht leis an mbreiseán chun sainiúlacht a mhéadú agus spleáchas an tríú cur chuige a laghdú, leas iomlán a bhaint as ian maignéisiam.Chun na torthaí is fearr a fháil, ba cheart tiúchan na mbreiseán a bharrfheabhsú, go háirithe DMSO, formamide, agus gliocról, a chuireann bac ar Taq DNA polymerase.
10. Tús te
Tús te Tá PCR ar cheann de na modhanna is tábhachtaí chun sainiúlacht PCR a fheabhsú chomh maith le dearadh primer maith.Cé go bhfuil an teocht fadaithe is fearr de Taq DNA polymerase 72 ℃, tá an polymerase fós gníomhach ag teocht an tseomra.Dá bhrí sin, déantar táirgí neamhshonracha a tháirgeadh nuair a bhíonn an teocht sealbhaíochta níos ísle ná an teocht annealing le linn ullmhú an imoibrithe PCR agus ag tús na timthriall teirmeach.Nuair a fhoirmítear iad, déantar na táirgí neamhshonracha seo a aimpliú go héifeachtach.Tá PCR tosaithe go háirithe éifeachtach nuair a bhíonn na suíomhanna a úsáidtear le haghaidh dearadh primer teoranta ag suíomh na n-eilimintí géiniteacha, mar shócháin atá treoraithe ag an suíomh, clónáil slonn, nó tógáil agus ionramháil eilimintí géiniteacha a úsáidtear le haghaidh innealtóireacht DNA.
Modh coitianta chun gníomhaíocht Taq DNA polymerase a theorannú ná réiteach imoibrithe PCR a ullmhú ar oighear agus é a chur i bhfearas PCR réamhthéite.Tá an modh seo simplí agus saor, ach ní chuireann sé gníomhaíocht an einsím i gcrích agus dá bhrí sin ní chuireann sé deireadh le aimpliú táirgí neamhshonracha go hiomlán.
Cuireann príomhú teirmeach moill ar shintéis DNA trí chomhpháirt riachtanach a chosc go dtí go sroicheann an gaireas PCR teocht dínádúraithe.Tá an chuid is mó de mhodhanna tionscnaimh láimhe teirmeacha, lena n-áirítear moill ar chur leis Taq DNA polymerase, an-deacair, go háirithe d'fheidhmchláir ard-thréchuir.Úsáideann modhanna priming teirmeach eile sciath céir chun comhpháirt riachtanach a imfhálú, lena n-áirítear iain mhaignéisiam nó einsímí, nó chun comhpháirteanna imoibríocha, amhail teimpléid agus maoláin, a leithlisiú go fisiciúil.Le linn an timthrialla teirmeach, scaoiltear agus measctar na comhpháirteanna éagsúla le chéile de réir mar a leá an céir.Cosúil leis an modh tosaithe te láimhe, tá an modh sciath céir achrannach agus seans maith d'éilliú agus níl sé oiriúnach d'iarratais tréchur ard.
Tá DNA platanam polymerase áisiúil agus éifeachtach le haghaidh tús te uathoibríoch PCR.Platanam Taq DNA polymerase comhdhéanta de athchuingreach Taq DNA polymerase in éineacht le antashubstaint monaclónach i gcoinne Taq DNA polymerase.Déantar na hantasubstaintí a fhoirmiú trí PCR chun gníomhaíocht einsíme a chosc le linn coinneáil teochta fada.Scaoileadh Taq DNA polymerase isteach san imoibriú le linn insliú 94 ℃ den chéim dínádúraithe, ag athshlánú gníomhaíocht iomlán polaiméaráis.I gcodarsnacht leis an polaiméaráis Taq DNA modhnaithe go ceimiceach le haghaidh tionscnamh teirmeach, ní gá insliú fada ag 94 ℃ (10 go 15 nóiméad) einsím Platanam chun an polymerase a ghníomhachtú.Le polaiméaráis PlatinumTaq DNA, athchóiríodh 90% de ghníomhaíocht polaiméaráis Taq DNA tar éis 2 nóiméad ag 94 ℃.
11. Nead-PCR
Is féidir feabhas a chur ar shainiúlacht agus ar íogaireacht i mbabhtaí aimpliúcháin leantacha ag baint úsáide as priméirí neadaithe.Is aimpliú caighdeánach 15 go 20 timthriall é an chéad bhabhta.Caolaíodh codán beag den táirge aimpliúcháin tosaigh 100 go 1000 uair agus cuireadh leis an dara babhta aimpliúcháin ar feadh 15 go 20 timthriall.De rogha air sin, is féidir an táirge aimplithe tosaigh a mhéid le íonú glóthach.Úsáidtear primer neadaithe sa dara babhta den aimpliú, ar féidir leis ceangal leis an seicheamh sprice laistigh den chéad primer.Laghdaíonn úsáid PCR neadaithe an fhéidearthacht go ndéanfaí illáithreáin sprice a aimpliú toisc nach bhfuil mórán seicheamh sprice ann a chomhlánaíonn an dá shraith de phriméirí.Mhéadaigh líon iomlán na dtimthriallta céanna (30 go 40) leis na primers céanna na suíomhanna neamhshonracha.Méadaíonn PCR neadaithe íogaireacht na seicheamh sprioc teoranta (eg, mrnas annamh) agus feabhsaíonn sé sainiúlacht PCRS deacra (eg 5′ RACE).
12. PCR íslitheach
Feabhsaíonn PCR íslitheach sainiúlacht trí úsáid a bhaint as coinníollacha daingean annealaithe don chéad chúpla timthriall de PCR.Tosaíonn an timthriall ag teocht annealing thart ar 5 ℃ níos airde ná an Tm measta, ansin laghdaítear gach timthriall 1 ℃ go 2 ℃ go dtí go bhfuil an teocht annealing faoi bhun Tm 5 ℃.Ní dhéanfar ach an teimpléad cinn scríbe a bhfuil an homaleolaíocht is airde aige a aimpliú.Leanann na táirgí seo ag leathnú i dtimthriallta ina dhiaidh sin, agus na táirgí neamhshonracha aimplithe á bplódú amach.Tá PCR íslitheach úsáideach le haghaidh modhanna nach eol méid na homaleolaíochta idir an primer agus an sprioc-theimpléad, amhail méarlorgaireacht DNA AFLP.
Feisteáin PCR Gaolmhara
An Laoch 2 × PCRTMTá caoinfhulaingt níos airde ag an gcóras meascáin ar choscóirí PCR ná an gnáthchóras PCR Mix, agus is féidir leis déileáil go héasca le aimpliú PCR ar theimpléid casta éagsúla.Mar gheall ar an gcóras imoibrithe uathúil agus ard-éifeachtúlacht Taq Hero tá éifeachtacht aimplithe, sainiúlacht agus íogaireacht níos airde ag imoibriú PCR.
Éifeachtúlacht aimpliúcháin níos airde
Tá gníomhaíocht pholaiméiráis DNA 5'→3' aige agus gníomhaíocht exonuclease 5'→3', gan gníomhaíocht exonuclease 3'→5'.
Fíor-ama PCR Easy-SYBR Green I Kit
Is féidir le maolán sain-optamaithe agus einsím Taq tús-te cosc a chur ar aimpliú neamhshonrach agus ar fhoirmiú dimer primer
Ard-íogaireacht - is féidir cóipeanna ísle den teimpléad a bhrath
Úsáideann an trealamh imoibrí trascríobh droim ar ais Foregene uathúil agus Polymerase DNA Foregene HotStar Taq in éineacht le córas imoibrithe uathúil chun éifeachtacht aimplithe agus sainiúlacht an imoibrithe a fheabhsú go héifeachtach.
Am postála: Bealtaine-09-2023
