Ní féidir le tras-scríbhinní droim ar ais traidisiúnta teochtaí arda a fhulaingt (is é 37-50°C an teocht is fearr le haghaidh gníomhaíochta MMLV, agus AMV 42-60°C).Ní féidir an RNA víreasach níos casta a thras-scríobh go héifeachtach go cDNA ag teochtaí ísle, rud a fhágann éifeachtúlacht braite An laghdú.Go ginearálta éilíonn RT-qPCR traidisiúnta rannpháirtíocht dhá phríomh-einsímí (transcriptase droim ar ais agus DNA polymerase), rud a fhágann go bhfuil sé dodhéanta oibriú an chórais imoibrithe a shimpliú agus an costas a laghdú.Anseo tabharfaimid isteach dhá thrascríobh droim ar ais ardteochta-resistant, TtH agus RevTaq.Tá feidhm DNA polymerase ag an dá einsím seo freisin, mar sin tugtar einsímí défheidhmeacha orthu.

TtH DNA polaiméire

Caithfidh gur chuala tú faoi TtH, a dhíorthaítear ón mbaictéar teirmeafilic Thermus thermophilus HB8.I láthair na gcatálacha défhiúsacha amhail Mg2+, tá gníomhaíocht DNA polaiméaráis aige.Úsáidtear go forleathan é in imoibrithe PCR cosúil le einsím Taq, ach tá friotaíocht teasa níos airde aige ná einsím Taq, agus mar sin tá éifeacht níos fearr aige freisin ar PCR le teimpléid ard-ábhar GC.

· Go bunúsach níl aon ghníomhaíocht exonuclease 3′→5′ agus gníomhaíocht exonuclease 5′→3′ ag an einsím seo, agus mar sin is féidir é a úsáid freisin le haghaidh seicheamhú dideoxy.

· Tá gníomhaíocht RTase ag an einsím seo.I láthair Mn2+, cuirfear le gníomhaíocht RTase.Ag baint úsáide as an ngné seo, is féidir é a úsáid chun imoibriú trascríobh droim ar ais agus imoibriú PCR a dhéanamh sa fheadán céanna, is é sin, RT-PCR aon-chéim.Mar sin féin, i láthair Mn2+, níl cruinneas RT-PCR ard.Níl baint ar bith ag gníomhaíocht RT le gníomhaíocht rnaase H.

· Sáraíonn gníomhaíocht mhéadaithe Tth-DNA polymerase (pH9, optimum +55 ℃ ～+70 ℃, uasmhéid +95 ℃) na fadhbanna a chruthaíonn struchtúr tánaisteach RNA.Is féidir an cDNA mar thoradh air a mhéadú trí PCR leis an einsím chéanna i láthair na n-ian Mg2+.

· Mar gheall ar chumas Tth-DNA polymerase tras-scríobh droim ar ais agus aimpliú DNA a dhéanamh ag teochtaí arda, tá an einsím seo úsáideach le haghaidh RT-PCR cainníochtúil, clónáil, agus anailís léiriú géine ar RNA ceallacha agus víreasach.
· Úsáidtear Tth-DNA polaiméaráis le haghaidh RT-PCR chun RNA a mhéadú suas le 1kb.

Gnéithe agus buntáistí

Tth DNA polaiméire:

• Cinntigh méid an táirge imoibrithe slabhra polaiméaráise optamaithe (PCR), 1000 bp ar a laghad san imoibriú RT-PCR

• Glac le trífhosfáit dé-ocsairbúnúclóisíde modhnaithe mar fhoshraith

• Ní bhaineann sé le gníomhaíocht RNase H

• Tá cobhsaíocht teirmeach ard aige chun fadhbanna a shárú, a bhaineann de ghnáth leis an struchtúr ard tánaisteach atá i láthair in RNA

Polaiméaráis DNA RevTaq RT-PCR

A polymerase DNA teas-resistant le gníomhaíocht transcriptase droim ar ais

Is einsím défheidhmeach é RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase innealtóireacht, an-teas-resistant, le gníomhaíochtaí transcriptase droim ar ais agus DNA polymerase a fhaightear trí éabhlóid dhíreach agus saorga.

· Tá leathré polaiméire DNA RevTaq RT-PCR ag 95°C níos mó ná 40 nóiméad.

· Ceadaíonn polymerase DNA RevTaq RT-PCR trascríobh droim ar ais ardteochta go díreach ón teimpléad RNA, agus is féidir an chéim trascríobh droim ar ais a athdhéanamh go minic chun níos mó teimpléid cDNA a ghiniúint.

· Ceadaíonn polaiméaráis DNA RevTaq RT-PCR “céim nialasach” RT-PCR (gan aon chéim trascríobh droim ar ais isiteirmeach), mar go dtarlaíonn trascríobh droim ar ais agus aimpliú DNA ag an am céanna sa chéim shínte timthriallach PCR.Cothaíonn sé seo freisin an frithghníomh trascríobh droim ar ais ag teochtaí arda, rud a íoslaghdaíonn na fadhbanna a bhíonn ann maidir le leá an struchtúir láidir tánaisteach in RNA ag teochtaí arda.

· Mar gheall ar an bhfoirmle tosaithe te bunaithe ar atamer, beidh torthaí níos fearr ag polaiméaráis DNA RevTaq RT-PCR nuair a bhíonn an teocht annealaithe agus sínte níos airde ná 57°C.

· Ós rud é go bhfuil an einsím teas-resistant, moltar priméirí agus taiscéalaithe a dhearadh le leáphointí an-ard (>60°C).

· Moltar teocht na céime análaithe/sínte a bharrfheabhsú trí ghrádán teochta le linn phróiseas socraithe an imoibrithe.

· Dá airde an teocht, is airde sainiúlacht PCR.De ghnáth déantar an timthriall trascríobh droim ar ais ag teocht níos airde ná an timthriall PCR, toisc go mbíonn leáphointe níos airde ag hibridiú Teimpléad DNA Primer:RNA de ghnáth ná mar a bhíonn leáphointe DNA Primer:cDNA Template duplex.

· Tá RevTaq RT-PCR DNA polymerase innealtóireacht ghéiniteach agus optamaithe, agus tá an méid amplicon idir 60-300 bp.

Sroicheann teorainn bhrath polaiméireáis DNA RevTaq RT-PCR 4 chóip/

Tá an córas imoibrithe optamaithe (bunú primers pointe leá ard) léirithe san fhigiúr.Léiríonn RevTaq RT-PCR DNA polaiméaráis-tiomáinte RT-PCR íogaireacht níos fearr ná TaqPath 1-chéim RT-qPCR meascán máistir, agus braite níos ísle Sampla grádán caolaithe.

Tuilleadh buntáistí:

Feidhm tosaithe tapa → Is féidir an chéim dínádúraithe teirmeach tosaigh a scipeáil.

Foirmle atamer tosaithe te → Cuir gníomhaíocht einsíme 100% ar fáil láithreach agus cosc ​​a chur ar aimpliú neamhshonrach ag teochtaí ísle (<57°C).

Feidhm scoilte → Fágtar an chéim eastósctha RNA ar lár, toisc gur féidir le RevTaq RT-PCR DNA polymerase a phróiseáil samplaí imoibrithe amh.Féadann sé seicní cille ewcaryotáití, baictéir agus víris a scriosadh láithreach i dtimthriall te RT-PCR.

Leibhéal amhábhar IVD → caighdeáin ardchaighdeáin agus praghsanna thar a bheith iomaíoch