1. Eolas bunúsach (más mian leat an chuid turgnamhach a fheiceáil, le do thoil aistrigh go díreach chuig an dara cuid)

Mar imoibriú díorthaigh de PCR traidisiúnta, déanann PCR Fíor-ama monatóireacht go príomha ar athrú ar mhéid an táirge aimpliúcháin i ngach timthriall den imoibriú aimpliúcháin PCR i bhfíor-am trí athrú ar an comhartha fluaraiseachta, agus déanann sé anailís chainníochtúil ar an teimpléad tosaigh tríd an gcaidreamh idir an luach ct agus an cuar caighdeánach.

Is iad na sonraí sonracha RT-PCRbunlíne, tairseach fluaraiseachtaagusCt luach.

Modhanna coitianta lipéadaithe le haghaidh RT-PCR:

2. Céimeanna turgnamhacha

2.1 Maidir leis an ngrúpa turgnamhach- ní mór go mbeadh toibreacha iolracha sa ghrúpa, agus ní mór athrá bitheolaíocha a bheith ann.

2.2 Prionsabail an dearadh primer

Tá ①SiRNA speiceas-shonrach, agus beidh na sraitheanna de speicis éagsúla difriúil.

Tá ②SiRNA pacáistithe i bpúdar reoite-triomaithe, ar féidir é a stóráil go cobhsaí ar feadh 2-4 seachtaine ag teocht an tseomra.

2.3 Uirlisí nó imoibrithe a chaithfear a ullmhú roimh ré

2.4 Maidir leis na saincheisteanna nach mór aird a thabhairt orthu sna céimeanna sonracha turgnamhacha:

Próiseas aistrithe ①siRNA

1. Le haghaidh plating, is féidir leat pláta 24-tobar, pláta 12-tobar nó pláta 6-tobar a roghnú (tá an meántiúchan RNA atá beartaithe i ngach tobar de phláta 24-tobar thart ar 100-300 ng/uL), agus is é an dlús aistrithe is fearr de chealla suas le 60 % -80% nó mar sin

2. Tá na céimeanna aistrithe agus na ceanglais shonracha i gcomhréir go docht leis na treoracha.

3. Tar éis aistriú, is féidir samplaí a bhailiú laistigh de 24-72 uair an chloig le haghaidh braite mRNA (RT-PCR) nó braite próitéin laistigh de 48-96 uair an chloig (WB).

② próiseas eastósctha RNA

1. Cosc a chur ar éilliú ag einsímí exogenous.Áiríonn sé go príomha maisc agus lámhainní a chaitheamh go docht;ag baint úsáide as leideanna pípéad aimridithe agus feadáin PE;caithfidh an t-uisce a úsáidtear sa turgnamh a bheith Saor ó RNase.

2. Moltar dhá uair a dhéanamh mar a mholtar sa trealamh eastóscadh tapa, rud a fheabhsóidh an íonacht agus an toradh i ndáiríre.

3. Ní fhéadfaidh an leacht dramhaíola teagmháil a dhéanamh leis an gcolún RNA.

③ cainníochtú RNA

Tar éis an RNA a bhaint, is féidir é a chainníochtú go díreach le Nanodrop , agus is féidir an léamh íosta a bheith chomh híseal le 10ng/ul.

④ Próiseas trascríobh droim ar ais

1. Mar gheall ar íogaireacht ard RT-qPCR, ba cheart 3 tobar comhthreomhar ar a laghad a dhéanamh do gach sampla chun cosc ​​a chur ar an Ct ina dhiaidh sin ó bheith ró-dhifriúil nó an SD a bheith ró-mhór le haghaidh anailíse staidrimh.

2. Ná reoite agus leá Máistir meascán arís agus arís eile.

3. Ní mór tip nua a chur in ionad gach feadáin/poll!Ná húsáid go leanúnach an leid pípéad céanna chun samplaí a chur leis!

4. Ní mór an scannán atá ceangailte leis an pláta 96-tobar tar éis an sampla a chur leis a smoothed le pláta.Is fearr lártheifneoir a dhéanamh sula gcuirtear ar an meaisín é, ionas gur féidir leis an leacht ar bhalla an fheadáin sreabhadh síos agus boilgeoga aeir a bhaint.

⑤ Anailís cuar coitianta

2.5 Maidir le hanailís sonraí

Is féidir anailís sonraí qPCR a roinnt i gcainníochtú coibhneasta agus i gcainníochtú iomlán.Mar shampla, cealla sa ghrúpa cóireála i gcomparáid le cealla sa ghrúpa rialaithe,

Cé mhéad uair a athraíonn mRNA na géine X, is é seo cainníochtú coibhneasta;i líon áirithe cealla, mRNA an ghéin X

Cé mhéad cóip atá ann, is cainníochtú iomlán é seo.De ghnáth is é an modh cainníochtúil coibhneasta is mó a úsáidimid sa tsaotharlann.De ghnáth,an modh 2-ΔΔctúsáidtear an chuid is mó i dturgnaimh , mar sin ní bheidh ach an modh seo a thabhairt isteach go mion anseo.

Modh 2-ΔΔct: Is é an toradh a fhaightear an difríocht i léiriú na sprice géine sa ghrúpa turgnamhach i gcoibhneas leis an spriocghéine sa ghrúpa rialaithe.Éilítear go bhfuil éifeachtúlachtaí aimpliúcháin an spriocghéine agus na géine tagartha inmheánacha araon gar do 100%, agus níor cheart go mbeadh an diall coibhneasta níos mó ná 5%.

Is é seo a leanas an modh ríofa:

Grúpa rialaithe Δct = luach ct na sprice géine sa ghrúpa rialaithe – luach ct na géine tagartha inmheánaigh sa ghrúpa rialaithe

Δct grúpa turgnamhach = luach ct na sprice géine sa ghrúpa turgnamhach – luach ct na géine tagartha inmheánaí sa ghrúpa turgnamhach

ΔΔct=Δct grúpa rialaithe turgnamhach-Δct

Ar deireadh, ríomh iolra na difríochta i leibhéal slonn:

Athraigh Fill=2-ΔΔct (a fhreagraíonn don fheidhm Excel is POWER é)

Táirgí gaolmhara:

Trealamh Cill Díreach RT-qPCR