1. Eolas bunúsach (más mian leat an chuid turgnamhach a fheiceáil, le do thoil aistrigh go díreach chuig an dara cuid)
Mar imoibriú díorthaigh de PCR traidisiúnta, déanann PCR Fíor-ama monatóireacht go príomha ar athrú ar mhéid an táirge aimpliúcháin i ngach timthriall den imoibriú aimpliúcháin PCR i bhfíor-am trí athrú ar an comhartha fluaraiseachta, agus déanann sé anailís chainníochtúil ar an teimpléad tosaigh tríd an gcaidreamh idir an luach ct agus an cuar caighdeánach.
Is iad na sonraí sonracha RT-PCRbunlíne, tairseach fluaraiseachtaagusCt luach.
bunlíne: | Is é luach fluaraiseachta an 3ú-15ú timthriall an bonnlíne (bunlíne), rud is cúis le earráid uaireanta an tomhais. |
Tairseach (tairseach): | Tagraíonn sé don teorainn braite fluaraiseachta atá socraithe ag suíomh cuí sa réigiún fáis easpónantúil den chuar aimpliúcháin, go ginearálta 10 n-uaire an diall caighdeánach den bhunlíne. |
Luach CT: | Is é líon na dtimthriallta PCR é nuair a shroicheann an luach fluaraiseachta i ngach feadán imoibrithe an tairseach. Tá luach Ct comhréireach go contrártha le méid an teimpléid tosaigh. |
Modhanna coitianta lipéadaithe le haghaidh RT-PCR:
modh | buntáiste | easnamh | raon feidhme an iarratais |
SYBR GlasⅠ | Infheidhmeacht leathan, íogair, saor agus áisiúil | Tá ceanglais primer ard, seans maith go bannaí neamhshonracha | Tá sé oiriúnach le haghaidh anailís chainníochtúil ar spriocghéinte éagsúla, taighde ar léiriú géine, agus taighde ar ainmhithe agus ar phlandaí athchuingeacha trasgenacha. |
TaqMan | Sainiúlacht mhaith agus atrialltacht ard | Tá an praghas ard agus níl sé oiriúnach ach le haghaidh spriocanna sonracha. | Brath pataigin, taighde géine friotaíochta drugaí, measúnú ar éifeachtúlacht drugaí, diagnóis galair ghéiniteacha. |
beacon móilíneach | Sainiúlacht ard, fluaraiseacht, cúlra íseal | Tá an praghas ard, níl sé oiriúnach ach le haghaidh cuspóir sonrach, tá an dearadh deacair, agus tá an praghas ard. | Anailís ghéin shonrach, anailís SNP |
2. Céimeanna turgnamhacha
2.1 Maidir leis an ngrúpa turgnamhach- ní mór go mbeadh toibreacha iolracha sa ghrúpa, agus ní mór athrá bitheolaíocha a bheith ann.
① | Rialú folamh | Úsáidtear é chun stádas fáis cille a bhrath i dturgnaimh |
② | siRNA rialaithe diúltach (seicheamh siRNA neamhshonrach) | Léirigh sainiúlacht na gníomhaíochta RNAi.féadfaidh siRNA freagairt struis neamhshonrach a chothú ag tiúchan 200nM. |
③ | Rialú Imoibrí Aistrithe | Fág tocsaineacht an imoibrí aistrithe chuig na cealla nó an éifeacht ar léiriú na sprice géine as an áireamh |
④ | siRNA i gcoinne sprice géine | Cnag síos léiriú na sprice géine |
⑤ (roghnach) | siRNA dearfach | Úsáidtear é chun fadhbanna córas turgnamhacha agus oibriúcháin a réiteach |
⑥ (roghnach) | SiRNA rialaithe fluaraiseacha | Is féidir éifeachtacht aistrithe cille a urramú le micreascóp |
2.2 Prionsabail an dearadh primer
Méid blúirí aimplithe | B'fhearr ag 100-150bp |
Fad Primer | 18-25bp |
Ábhar GC | 30% -70%, b'fhearr 45%-55% |
Tm luach | 58-60 ℃ |
Seicheamh | Seachain T/C leanúnach;A/G leanúnach |
3 seicheamh deiridh | Seachain GC saibhir nó AT saibhir;is fearr G nó C an bonn teirminéil;is fearr T a sheachaint |
Comhlántacht | Seachain seichimh chomhlántacha de níos mó ná 3 bhonn laistigh den primer nó idir dhá primer |
Sainiúlacht | Úsáid cuardach soinneáin chun sainiúlacht an primer a dhearbhú |
Tá ①SiRNA speiceas-shonrach, agus beidh na sraitheanna de speicis éagsúla difriúil.
Tá ②SiRNA pacáistithe i bpúdar reoite-triomaithe, ar féidir é a stóráil go cobhsaí ar feadh 2-4 seachtaine ag teocht an tseomra.
2.3 Uirlisí nó imoibrithe a chaithfear a ullmhú roimh ré
Primer (tagairt inmheánach) | Lena n-áirítear ar aghaidh agus droim ar ais dhá |
Primer (géine sprice) | Lena n-áirítear ar aghaidh agus droim ar ais dhá |
Sprioc Si RNA (3 stiall) | Go ginearálta, déanfaidh an chuideachta 3 stiallacha a shintéisiú, agus ansin ceann de na trí cinn a roghnú ag RT-PCR |
Kit Aistrithe | Lipo2000 srl. |
RNA Trealamh Astarraingthe Mear | Le haghaidh eastóscadh RNA tar éis aistriú |
Trealamh Mear Trascríobh Droim ar Ais | le haghaidh sintéise cDNA |
Trealamh Aimpliúcháin PCR | 2 × Glas SYBR Super Meascán máistir qPCR |
2.4 Maidir leis na saincheisteanna nach mór aird a thabhairt orthu sna céimeanna sonracha turgnamhacha:
Próiseas aistrithe ①siRNA
1. Le haghaidh plating, is féidir leat pláta 24-tobar, pláta 12-tobar nó pláta 6-tobar a roghnú (tá an meántiúchan RNA atá beartaithe i ngach tobar de phláta 24-tobar thart ar 100-300 ng/uL), agus is é an dlús aistrithe is fearr de chealla suas le 60 % -80% nó mar sin
2. Tá na céimeanna aistrithe agus na ceanglais shonracha i gcomhréir go docht leis na treoracha.
3. Tar éis aistriú, is féidir samplaí a bhailiú laistigh de 24-72 uair an chloig le haghaidh braite mRNA (RT-PCR) nó braite próitéin laistigh de 48-96 uair an chloig (WB).
② próiseas eastósctha RNA
1. Cosc a chur ar éilliú ag einsímí exogenous.Áiríonn sé go príomha maisc agus lámhainní a chaitheamh go docht;ag baint úsáide as leideanna pípéad aimridithe agus feadáin PE;caithfidh an t-uisce a úsáidtear sa turgnamh a bheith Saor ó RNase.
2. Moltar dhá uair a dhéanamh mar a mholtar sa trealamh eastóscadh tapa, rud a fheabhsóidh an íonacht agus an toradh i ndáiríre.
3. Ní fhéadfaidh an leacht dramhaíola teagmháil a dhéanamh leis an gcolún RNA.
③ cainníochtú RNA
Tar éis an RNA a bhaint, is féidir é a chainníochtú go díreach le Nanodrop , agus is féidir an léamh íosta a bheith chomh híseal le 10ng/ul.
④ Próiseas trascríobh droim ar ais
1. Mar gheall ar íogaireacht ard RT-qPCR, ba cheart 3 tobar comhthreomhar ar a laghad a dhéanamh do gach sampla chun cosc a chur ar an Ct ina dhiaidh sin ó bheith ró-dhifriúil nó an SD a bheith ró-mhór le haghaidh anailíse staidrimh.
2. Ná reoite agus leá Máistir meascán arís agus arís eile.
3. Ní mór tip nua a chur in ionad gach feadáin/poll!Ná húsáid go leanúnach an leid pípéad céanna chun samplaí a chur leis!
4. Ní mór an scannán atá ceangailte leis an pláta 96-tobar tar éis an sampla a chur leis a smoothed le pláta.Is fearr lártheifneoir a dhéanamh sula gcuirtear ar an meaisín é, ionas gur féidir leis an leacht ar bhalla an fheadáin sreabhadh síos agus boilgeoga aeir a bhaint.
⑤ Anailís cuar coitianta
Gan aon tréimhse fáis logartamach | B'fhéidir tiúchan ard teimpléid |
Gan luach CT | Céimeanna míchearta chun comharthaí fluaraiseacha a bhrath; díghrádú primers nó tóireadóirí – is féidir a sláine a bhrath le leictreafóiréis LEATHANACH; méid neamhleor an teimpléid; díghrádú teimpléid – tabhairt isteach eisíontais a sheachaint agus reo agus leá arís agus arís eile agus samplaí á n-ullmhú; |
Ct>38 | Éifeachtúlacht aimpliúcháin íseal;Tá táirge PCR ró-fhada;déantar comhpháirteanna imoibrithe éagsúla a dhíghrádú |
Cuar aimpliúcháin líneach | Féadfar tóireadóirí a dhíghrádú go páirteach trí thimthriallta reo-leáite arís agus arís eile nó trí nochtadh fada don solas |
Tá an difríocht i bpoill dhúbailt go háirithe mór | Níl an réiteach imoibrithe leáite go hiomlán nó nach bhfuil an réiteach imoibrithe measctha;tá folctha teirmeach na hionstraime PCR éillithe ag substaintí fluaraiseacha |
2.5 Maidir le hanailís sonraí
Is féidir anailís sonraí qPCR a roinnt i gcainníochtú coibhneasta agus i gcainníochtú iomlán.Mar shampla, cealla sa ghrúpa cóireála i gcomparáid le cealla sa ghrúpa rialaithe,
Cé mhéad uair a athraíonn mRNA na géine X, is é seo cainníochtú coibhneasta;i líon áirithe cealla, mRNA an ghéin X
Cé mhéad cóip atá ann, is cainníochtú iomlán é seo.De ghnáth is é an modh cainníochtúil coibhneasta is mó a úsáidimid sa tsaotharlann.De ghnáth,an modh 2-ΔΔctúsáidtear an chuid is mó i dturgnaimh , mar sin ní bheidh ach an modh seo a thabhairt isteach go mion anseo.
Modh 2-ΔΔct: Is é an toradh a fhaightear an difríocht i léiriú na sprice géine sa ghrúpa turgnamhach i gcoibhneas leis an spriocghéine sa ghrúpa rialaithe.Éilítear go bhfuil éifeachtúlachtaí aimpliúcháin an spriocghéine agus na géine tagartha inmheánacha araon gar do 100%, agus níor cheart go mbeadh an diall coibhneasta níos mó ná 5%.
Is é seo a leanas an modh ríofa:
Grúpa rialaithe Δct = luach ct na sprice géine sa ghrúpa rialaithe – luach ct na géine tagartha inmheánaigh sa ghrúpa rialaithe
Δct grúpa turgnamhach = luach ct na sprice géine sa ghrúpa turgnamhach – luach ct na géine tagartha inmheánaí sa ghrúpa turgnamhach
ΔΔct=Δct grúpa rialaithe turgnamhach-Δct
Ar deireadh, ríomh iolra na difríochta i leibhéal slonn:
Athraigh Fill=2-ΔΔct (a fhreagraíonn don fheidhm Excel is POWER é)
Táirgí gaolmhara:
Am postála: Bealtaine-20-2023