Ⅰ. Méadú ar íogaireacht an chórais imoibrithe:

1. RNA ard-chaighdeán ar leith:

Tagann sintéis rathúil cDNA ó RNA ardcháilíochta.Ba cheart go n-áiritheofaí RNA ardcháilíochta ar a laghad iomlán níos faide agus nach bhfuil coscairí ann nach bhfuil einsímí taifeadta iontu, amhail EDTA nó SDS.Cinneann cáilíocht RNA uasluach na faisnéise seichimh is féidir leat a thrascríobh chuig an cDNA.Is modh céime é an modh íonú RNA ginearálta chun isoocyanate / aigéadafenól a úsáid.Chun truailliú RNase a chosc, éilíonn an RNA atá scartha ó shampla atá saibhir i RNase (cosúil le briseán) formaildéad a stóráil chun RNA ard-chaighdeán a shábháil, rud atá níos mó fós le haghaidh stórála fadtéarmach.Díghrádaíodh an RNA a bhaintear as an ae francach go bunúsach tar éis seachtain amháin stórála in uisce, agus d'fhan an RNA a bhaintear as an spleen francach cobhsaí tar éis trí bliana de stóráil uisce.Ina theannta sin, tá tras-scríbhinní níos mó ná 4kb níos íogaire maidir le díghrádú RNase a rianú ná le tras-scríbhinní beaga.Chun cobhsaíocht an tsampla RNA stórála a mhéadú, is féidir an RNA a thuaslagadh i methalmamine ian, agus é a stóráil -70 °C.Ní ceadmhach rud ilghnéitheach a dhíghrádaíonn RNA a bheith i dtiolíd a úsáidtear chun RNA a shábháil.Is féidir RNA, a dhíorthaítear ó briseán, a shábháil i methalmamine ar feadh bliana ar a laghad.Nuair atá tú réidh le RNA a úsáid, is féidir leat na modhanna seo a leanas a úsáid chun RNA a deascadh: cuir NaCl le 0.2m agus 4 huaire an toirt eatánóil, cuir teocht an tseomra ar feadh 3-5 nóiméad, agus 10,000 × g lártheifeacha ar feadh 5 nóiméad.

2. Bain úsáid as transcriptase droim ar ais gan gníomhaíocht RNaseH (RNaseH-):

Is minic a chuirtear coscóirí RNase le frithghníomhartha trascríobh droim ar ais chun fad agus toradh sintéise cDNA a mhéadú.Cuirtear coscóir RNase leis sa chéad imoibriú sintéise slabhra i láthair maoláin agus gníomhairí laghdaitheacha cosúil le DTT toisc go ndínádúraíonn an próiseas sintéise réamh-cDNA an t-inhibitor, rud a scaoileann RNases faoi cheangal a dhíghrádaíonn RNA.Ní chuireann inhibitor RNase Próitéin ach cosc ​​​​ar dhíghrádú RNA ag RNase A, B, C, agus ní chuireann sé cosc ​​ar RNAses ar an gcraiceann, mar sin ba chóir cúram a ghlacadh gan RNase a thabhairt isteach ó na méara in ainneoin úsáid a bhaint as na coscairí seo.

Déanann transcriptase droim ar ais catalú ar thiontú RNA ina cDNA.Tá gníomhaíocht RNaseH endogenous ag M-MLV agus AMV araon chomh maith lena ngníomhaíocht polaiméireáis féin.Tá gníomhaíocht RNaseH in iomaíocht le gníomhaíocht pholaiméiráis do shnáitheanna heitrisigeacha a chruthaítear idir teimpléid RNA agus primers DNA nó snáitheanna síneadh cDNA, agus díghrádaíonn sí RNA: snáitheanna RNA i gcoimpléisc DNA.Ní féidir teimpléid RNA díghrádaithe ag gníomhaíocht RNaseH a úsáid a thuilleadh mar fhoshraitheanna éifeachtacha do shintéis cDNA, ag laghdú toradh agus fad sintéise cDNA.Dá bhrí sin bheadh ​​sé ina bhuntáiste mór deireadh a chur le gníomhaíocht RNaseH de thrascríobh droim ar ais nó a laghdú go mór.

Fuarthas tras-scríbhinn droim ar ais SuperScriptⅡ, trascríobh droim ar ais MMLV de RNaseH- agus tras-scríbhinn droim ar ais thermoScript, AMV de RNaseH- níos mó cDNA fad iomlán ná MMLV agus AMV.Bíonn tionchar ag íogaireacht RT-PCR ar an méid cDNA sintéiseithe.Tá ThermoScript i bhfad níos íogaire ná AMV.Tá méid na dtáirgí RT-PCR teoranta ag cumas an transcriptase droim ar ais chun cDNA a shintéisiú, go háirithe nuair a bhíonn Cdnas níos mó á chlónáil.I gcomparáid le MMLV, tháinig méadú suntasach ar SuperScripⅡ ar tháirgeacht táirgí fada RT-PCR.Méadaíonn trascríobh droim ar ais RNaseH- cobhsaíocht theirmeach freisin, ionas gur féidir an t-imoibriú a dhéanamh ag teochtaí níos airde ná mar is gnách 37-42 ℃.Faoi na coinníollacha sintéise molta, baineadh úsáid as primers oligo(dT) agus 10μCi [alpha-p]dCTP.Ríomhadh táirgeadh iomlán an chéad slabhra ag baint úsáide as modh deascadh TCA.Rinneadh anailís ar cDNA lánfhad agus úsáid á baint as stiallacha méid-sórtáilte a bhaint agus a chomhaireamh i nglóthach agairóis alcaileach.

3. An teocht caomhnaithe teasa de thrascríobh droim ar ais a mhéadú:

Cuidíonn teocht sealbhaíochta níos airde le struchtúr tánaisteach RNA a oscailt agus toradh an imoibrithe a mhéadú.I gcás fhormhór na dteimpléad RNA, má choinnítear an RNA agus an primer ag 65°C gan maolán ná salann agus ansin iad a fhuarú go tapa ar oighear, scriostar an chuid is mó de na struchtúir thánaisteacha agus ligeann sé do na primers a cheangal.Mar sin féin, tá struchtúr tánaisteach fós ag roinnt teimpléid, fiú tar éis dínádúrú teirmeach.Is féidir aimpliú na dteimpléad deacra seo a dhéanamh ag baint úsáide as ThermoScript droim ar ais transcriptase agus tríd an imoibriú transcriptase droim ar ais a chur ag teochtaí níos airde chun aimpliú a fheabhsú.Is féidir le teochtaí coinneála níos airde sainiúlacht a mhéadú freisin, go háirithe nuair a dhéantar sintéis cDNA ag baint úsáide as primers géine-shonracha (GSPS) (féach Caibidil 3).Má tá GSP in úsáid agat, cinntigh go bhfuil luach Tm an phréimhe mar an gcéanna leis an teocht shealbhaíochta ionchais.Ná húsáid oligo(dT) agus primers randamach os cionn 60 ℃.Ní mór primers randamach a choinneáil ag 25 ℃ ar feadh 10 nóiméad sula méadaítear iad go 60 ℃.Chomh maith le teochtaí trascríobh droim ar ais níos airde a úsáid, is féidir sainiúlacht a fheabhsú tríd an meascán RNA/primer a aistriú go díreach ón teocht dínádúraithe 65 ℃ go dtí an teocht sealúchais trascríobh droim ar ais agus trí mheascán imoibrithe réamhthéite 2 × (sintéis tionscnamh teirmeach cDNA) a chur leis.Cuidíonn an cur chuige seo le cosc ​​a chur ar phéireáil bonn idirmhóilíneach a tharlaíonn ag teochtaí níos ísle.Trí úsáid a bhaint as ionstraim PCR simplítear an iliomad lasca teochta a theastaíonn le haghaidh RT-PCR.

Feidhmíonn an tth polaiméaráis cobhsaithe teasa mar pholaiméiráis DNA i láthair Mg2+ agus RNA polaiméaráis i láthair Mn2+.Is féidir leis an teas a choinneáil suas le 65 ℃.Mar sin féin, laghdaíonn láithreacht Mn2+ le linn PCR dílseacht, rud a fhágann nach bhfuil Tth polymerase chomh hoiriúnach le haghaidh aimpliú ardchruinneas, mar chlónáil cDNA.Ina theannta sin, níl Tth chomh héifeachtach le tras-scríobh droim ar ais, rud a laghdaíonn íogaireacht, agus ós rud é gur féidir le heinsím amháin trascríobh droim ar ais agus PCR a dhéanamh, ní féidir imoibrithe rialaithe gan tras-trascríobh droim ar ais a úsáid chun táirgí aimplithe cDNA a idirdhealú ó tháirgí DNA géanóm éillithe.

4. Breiseán a chuireann trascríobh droim ar ais:

Is féidir le breiseáin, lena n-áirítear glycerin agus DMSO, a chur leis an gcéad imoibriú sintéise slabhra cobhsaíocht an tsnáithe dúbailte aigéid núicléigh a laghdú agus an struchtúr tánaisteach RNA a dhíshealbhú.Is féidir suas le 20% glycerin nó 10% DMSO a chur leis gan cur isteach ar ghníomhaíocht SuperScriptⅡ nó MMLV.Is féidir le AMV suas le 20% gliocról a fhulaingt freisin gan gníomhaíocht a laghdú.Chun íogaireacht RT-PCR a uasmhéadú in imoibriú trascríobh droim ar ais SuperScriptⅡ, is féidir gliocról 10% a chur leis agus a insliú ag 45 ℃.Má chuirtear 1/10 den táirge frithghníomhaithe retrotrascríobh leis an PCR, is é 0.4% an tiúchan gliocról san imoibriú aimpliúcháin, rud nach leor chun PCR a chosc.

5. Próiseáil RNaseH:

Is féidir íogaireacht a fheabhsú trí fhrithghníomhartha sintéise cDNA a chóireáil le RNaseH roimh PCR.I gcás roinnt teimpléid, meastar go gcuireann an RNA san imoibriú sintéise cDNA cosc ​​ar tháirgí aimplithe a cheangal, agus sa chás sin is féidir le cóireáil RNaseH íogaireacht a mhéadú.Go ginearálta, tá gá le cóireáil RNaseH chun teimpléad sprice cDNA lán-fhad sách fada a aimpliú, mar shampla scherosis tuberousⅡ le cóip íseal.Maidir leis an teimpléad deacair seo, chuir RNaseH feabhas ar an comhartha a ghineann an cDNA sintéiseithe ag SuperScriptⅡ nó AMV.I gcás formhór na n-imoibrithe RT-PCR, tá an chóireáil RNaseH roghnach toisc go hidrealaíonn céim dínádúraithe PCR inslithe 95 ℃ an RNA ón RNA: coimpléasc DNA.

6. Modhanna feabhsaithe chun méideanna beaga RNA a bhrath:

Tá RT-PCR go háirithe dúshlánach nuair nach bhfuil ach méideanna beaga RNA ar fáil.Cuidíonn cur leis glycogen mar iompróir le linn scaradh RNA le táirgeacht samplaí beaga a mhéadú.Is féidir glycogen saor ó RNase a chur leis ag an am céanna le Trizol.Tá Glycogen intuaslagtha in uisce agus féadann sé fanacht sa chéim uisce le RNA chun cuidiú le deascadh ina dhiaidh sin.Is é an tiúchan molta de glycogen saor ó RNase ná 250 μg/ml le haghaidh samplaí níos lú ná 50mg fíocháin nó 106 cealla saothraithe.

Is féidir le BSA aicéitilithe a chur le frithghníomhartha trascríobh droim ar ais ag baint úsáide as SuperScriptⅡ an íogaireacht a mhéadú, agus le haghaidh méideanna beaga RNA, is féidir leis an méid SuperScriptⅡ a laghdú agus 40 aonad de inhibitor nuclease RnaseOut a chur leis an leibhéal braite a fheabhsú.Má úsáidtear glycogen i scaradh RNA, moltar fós coscairí BSA nó RNase a chur leis chun frithghníomhartha trascríobh a aisiompú ag baint úsáide as SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Méadú ar shainiúlacht RT-PCR

1. sintéis cNDA:

Is féidir trí mhodhanna éagsúla a úsáid chun sintéis cDNA an chéad snáithe a thionscnamh, agus bíonn tionchar ag sainiúlacht choibhneasta gach modh ar mhéid agus ar chineál an cDNA sintéiseithe.

Is é modh primer randamach an ceann is lú sonraíocht de na trí mhodhanna.Cuirtear priméirí annealaithe ag láithreáin iolracha ar fud na tras-scríbhinne chun cDNA gearr, páirtfhada a tháirgeadh.Is minic a úsáidtear an modh seo chun seichimh teirminéil 5′ agus cDNA a fháil ó theimpléid RNA le réigiúin struchtúracha tánaisteacha nó le suíomhanna foirceanta nach féidir le transcriptase droim ar ais a mhacasamhlú.Chun an cDNA is faide a fháil, ní mór an cóimheas idir na primers agus RNA i ngach sampla RNA a chinneadh go heimpíreach.Raonta an tiúchan tosaigh de primers randamach ó 50 go 250ng in aghaidh an chórais imoibrithe 20μl.Toisc go bhfuil an cDNA sintéiseithe ó RNA iomlán ag baint úsáide as primers randamacha go príomha RNA ribosomal, poly(A) + RNA a roghnaítear de ghnáth mar an teimpléad.

Tá tionscnamh Oligo(dT) níos sainiúla ná priméirí randamacha.Hibridíonn sé leis an eireaball polai(A) a fhaightear ag deireadh 3′ mRNA i bhformhór na gceall eocaryotic.Toisc go bhfuil poly(A)+RNA thart ar 1% go 2% den RNA iomlán, tá méid agus castacht cDNA i bhfad níos lú ná mar a d’úsáidfí primers randamach.Mar gheall ar a shainiúlacht ard, go ginearálta ní éilíonn oligo(dT) leas iomlán a bhaint as cóimheas RNA go primer agus roghnú polai(A)+.Moltar 0.5μg oligo(dT) a úsáid in aghaidh an chórais imoibrithe 20μl.Tá oligo(dT)12-18 oiriúnach don chuid is mó de RT-PCR.Soláthraíonn Córas ThermoScript RT-PCR oligo(dT)20 mar gheall ar a chobhsaíocht theirmeach maith agus tá sé oiriúnach le haghaidh teochtaí coinneála níos airde.

Is iad primers géine-shonracha (GSP) na primers sonracha is fearr don chéim trascríobh droim ar ais.Is oligonucleoside antisense é GSP atá in ann hibridiú go sonrach le seichimh chinn scríbe RNA, seachas gach Rnas a anneal mar phriméirí randamach nó oligo(dT).Baineann na rialacha a úsáidtear chun primers PCR a dhearadh freisin le dearadh GSP imoibriúcháin trascríobh droim ar ais.Is féidir le GSP a bheith san ord céanna leis an primer aimpliúcháin atá annealaithe ag deireadh mRNA3′, nó is féidir GSP a dhearadh chun a bheith annealaithe le sruth leis an bpriméir aimpliúcháin droim ar ais.I gcás roinnt rudaí aimplithe, is gá níos mó ná primer antisense amháin a dhearadh le haghaidh RT-PCR rathúil mar go bhféadfadh struchtúr tánaisteach an sprioc-RNA cosc ​​a chur ar an primer ó cheangal.Moltar 1pmol antisense GSP a úsáid sa chéad chóras imoibrithe sintéise slabhra de 20μl.

2. An teocht caomhnaithe teasa de thrascríobh droim ar ais a mhéadú:

D'fhonn leas iomlán a bhaint as sainiúlacht GSP, ba cheart transcriptase droim ar ais le cobhsaíocht teirmeach ard a úsáid.Is féidir transcriptase droim ar ais teas-cobhsaí a insliú ag teochtaí níos airde chun déine imoibrithe a mhéadú.Mar shampla, má chuirtear GSP annealaithe ag 55°C, ní bhaintear leas iomlán as sainiúlacht an GSP má dhéantar an tras-scríobh droim ar ais ag 37°C le déine íseal ag baint úsáide as AMV nó M-MLV.Mar sin féin, is féidir le SuperScripⅡ agus ThermoScript imoibriú ag 50 ℃ nó níos airde, rud a chuireann deireadh le táirgí neamhshonracha a tháirgtear ag teochtaí níos ísle.Ar mhaithe le sainiúlacht uasta, is féidir an meascán RNA/primer a aistriú go díreach ón teocht dínádúraithe 65 ℃ go dtí an teocht sealúchais trascríobh droim ar ais trí mheascán imoibrithe réamhthéite 2 x (tionscnamh teirmeach sintéise cDNA) a chur leis.Cuidíonn sé seo le péireáil bonn a chosc idir móilíní ag teochtaí ísle.Trí ionstraim PCR a úsáid, simplítear na haistrithe teochta iomadúla a theastaíonn le haghaidh RT-PCR.

3. Éilliú DNA genomic a laghdú:

Deacracht amháin a d’fhéadfadh a bheith ann le RT-PCR ná go n-éilíonn RNA DNA genomic.Laghdaíonn úsáid modhanna scaradh RNA níos fearr, mar shampla Trizol Imoibrí, éilliú DNA genomic in ullmhóidí RNA.Chun táirgí a tháirgtear ó DNA géanómach a sheachaint, is féidir an RNA a chóireáil le grád aimplithe DnasⅠ chun DNA éillithe a bhaint roimh an trascríobh droim ar ais.Coinníodh na samplaí ag 65 ℃ in EDTA 2.0mM ar feadh 10 nóiméad chun deireadh a chur le díleá DNaseⅠ.Chealaíonn EDTA hiain mhaignéisiam chun hidrealú RNA atá ag brath ar ian maignéisiam a chosc a tharlaíonn ag teochtaí arda.

D'fhonn cDNA aimplithe a dheighilt ón táirge aimplithe DNA genome, is féidir primers a annealann ar leithligh leis an eason deighilte a dhearadh.Beidh táirgí PCR a dhíorthaítear ó cDNA níos giorra ná iad siúd a dhíorthaítear ó DNA géanóm éillithe.Déantar turgnamh rialaithe gan tras-scríobh droim ar ais ar gach teimpléad RNA freisin chun a chinneadh an bhfuil blúire tugtha ó DNA géanóm nó cDNA.Díorthaítear táirgí PCR a fhaightear in éagmais trascríobh droim ar ais ón genome.

Táirge Gaolmhar

RT-PCR Éasca^ᵀᴹI (Céim amháin)

-Cuireann an trealamh aon-chéim ar chumas trascríobh droim ar ais agus PCR a dhéanamh san fheadán céanna.Ní gá dó ach teimpléad RNA, primers PCR ar leith agus ddH RNase-Free a chur leis₂O.

-Is féidir anailís chainníochtúil fíor-ama ar RNA a dhéanamh go tapa agus go cruinn.

-Úsáideann an trealamh imoibrí trascríobh droim ar ais Foregene uathúil agus Polymerase DNA Foregene HotStar Taq in éineacht le córas imoibrithe uathúil chun éifeachtacht aimplithe agus sainiúlacht an imoibrithe a fheabhsú go héifeachtach.

-Déanann an córas imoibrithe optamaithe go bhfuil íogaireacht bhrath níos airde, cobhsaíocht theirmeach níos láidre, agus caoinfhulaingt níos fearr ag an imoibriú.

RT Easy II(Le GDNase) Máistir Premix Do Shintéis CDNA Céad Snáithe Do PCR Fíor-ama Le GDNase

-Cumas éifeachtach chun gDNA a bhaint, is féidir a bhaint as gDNA sa teimpléad laistigh de 2 nóiméad.

-Córas trascríobh droim ar ais éifeachtach, ní thógann sé ach 15 nóiméad chun sintéis an chéad snáithe cDNA a chríochnú.

-Teimpléid choimpléasc: is féidir teimpléid le hábhar ard GC agus struchtúr tánaisteach casta a aisiompú freisin le héifeachtacht ard.

-Córas trascríobh droim ar ais ard-íogaireachta, is féidir le teimpléid leibhéal lch cDNA ardcháilíochta a fháil freisin.

-Tá cobhsaíocht teirmeach ard ag an gcóras trascríobh droim ar ais, is é 42 ℃ an teocht imoibrithe is fearr, agus tá dea-fheidhmíocht trascríobh droim ar ais fós ag 50 ℃.