一, Méadú ar íogaireacht an chórais imoibrithe:

1. Leithlisiú RNA ardchaighdeáin:

Tagann sintéis rathúil cDNA ó RNA ardcháilíochta.Ba cheart go mbeadh RNA ardcháilíochta ar a laghad lán-fhad agus saor ó choscóirí trascríobh droim ar ais mar EDTA nó SDS.Cinneann cáilíocht RNA an t-uasmhéid faisnéise seichimh is féidir leat a thrascríobh go cDNA.Is modh aonchéime é modh íonú RNA coiteann a úsáideann guanidine iseatiocianáit / feanól aigéadach.Chun éilliú trí rianmhéideanna RNase a chosc, ní mór RNA atá scoite ó shamplaí saibhir RNase (cosúil le briseán) a stóráil i formaildéad chun RNA ardcháilíochta a chaomhnú, go háirithe le haghaidh stórála fadtéarmach.Díghrádaíodh an RNA a bhaintear as ae francach go bunúsach tar éis é a stóráil in uisce ar feadh seachtaine amháin, agus d'fhan an RNA a bhaintear as spleen francach cobhsaí tar éis é a stóráil in uisce ar feadh 3 bliana.Ina theannta sin, tá tras-scríbhinní níos faide ná 4 kb níos íogaire do dhíghrádú de réir rian RNases ná tras-scríbhinní beaga.Chun cobhsaíocht na samplaí RNA stóráilte a mhéadú, is féidir RNA a thuaslagadh i bhfoirmimíd dí-ianaithe agus é a stóráil ag -70°C.Ní mór don fhoirmimíd a úsáidtear chun RNA a chaomhnú a bheith saor ó bhruscar atá díghrádaithe ag RNA.Is féidir RNA ón briseán a chaomhnú i formamide ar feadh bliana ar a laghad.Agus tú ag ullmhú chun RNA a úsáid, is féidir leat an modh seo a leanas a úsáid chun RNA a deascadh: cuir NaCl le 0.2M agus 4 huaire toirt an eatánóil, cuir ag teocht an tseomra ar feadh 3-5 nóiméad, agus lártheifneoir ag 10,000 × g ar feadh 5 nóiméad.

2. Úsáid an tras-scríbhinn droim ar ais RNaseH-inactive (RNaseH-):

Is minic a chuirtear coscóirí RNase le frithghníomhartha trascríobh droim ar ais chun fad agus toradh sintéise cDNA a mhéadú.Ba cheart coscairí RNase a chur leis le linn imoibriú sintéise na chéad sraithe i láthair maoláin agus oibreáin laghdaitheora (cosúil le DTT), toisc go ndínádúraíonn an próiseas roimh shintéis cDNA an t-iniúchadh, rud a scaoileann RNase faoi cheangal a d'fhéadfadh RNA a dhíghrádú.Ní choisceann coscairí RNase Próitéin ach díghrádú RNA ag RNase A, B, C, agus ní chuireann siad cosc ​​ar RNase ar an gcraiceann, mar sin bí cúramach gan RNase a thabhairt isteach ó do mhéara in ainneoin úsáid a bhaint as na coscairí seo.

Déanann transcriptase droim ar ais catalú ar thiontú RNA go cDNA.Tá gníomhaíocht RNaseH endogenous ag M-MLV agus AMV araon chomh maith lena ngníomhaíocht polaiméireáis féin.Téann gníomhaíocht RNaseH agus gníomhaíocht pholaiméiráis in iomaíocht lena chéile don snáithe hibrideach a fhoirmítear idir an teimpléad RNA agus an primer DNA nó snáithe síntí cDNA, agus díghrádaíonn siad an snáithe RNA sa choimpléasc RNA:DNA.Ní féidir leis an teimpléad RNA atá díghrádaithe ag gníomhaíocht RNaseH feidhmiú mar fhoshraith éifeachtach do shintéis cDNA a thuilleadh, rud a laghdaíonn toradh agus fad sintéise cDNA.Mar sin, bheadh ​​sé tairbheach deireadh a chur le gníomhaíocht RNaseH de thrascríobh droim ar ais nó a laghdú go mór..

Is féidir le SuperScript Ⅱ droim ar ais transcriptase, RNaseH- MMLV droim ar ais transcriptase agus thermoScript droim ar ais transcriptase, RNaseH- AMV, méid níos mó agus fad níos mó cDNA a fháil ná MMLV agus AMV.Beidh tionchar ag íogaireacht RT-PCR ar an méid sintéise cDNA.Tá ThermoScript i bhfad níos íogaire ná AMV.Tá méid na dtáirgí RT-PCR teoranta ag cumas transcriptase droim ar ais chun cDNA a shintéisiú, go háirithe nuair a dhéantar cDNAanna níos mó a chlónáil.I gcomparáid le MMLV, tháinig méadú suntasach ar SuperScripⅡ ar tháirgeacht táirgí fada RT-PCR.Tá an teirmeastatacht méadaithe ag an transcriptase-droim ar ais RNaseH freisin, ionas gur féidir an t-imoibriú a dhéanamh ag teochtaí níos airde ná an gnáth 37-42 ° C.Faoi na coinníollacha sintéise molta, bain úsáid as primer oligo(dT) agus 10 μCi de [α-P]dCTP.Ríomhadh toradh iomlán na chéad sraithe trí úsáid a bhaint as modh deasctha ACCán.Rinneadh anailís ar cDNA lánfhad agus úsáid á baint as bandaí méid-sórtáilte arna ngearradh agus á gcomhaireamh ar fhoirmiú agairóis alcaileach.

3. Ardaigh an teocht goir le haghaidh trascríobh droim ar ais:

Cuidíonn teocht goir níos airde le struchtúr tánaisteach RNA a oscailt, ag méadú toradh an imoibrithe.I gcás fhormhór na dteimpléad RNA, má chothaítear an RNA agus na primers ag 65°C gan maolán nó salann, agus ina dhiaidh sin fuarú tapa ar oighear, cuirfear deireadh leis an gcuid is mó de na struchtúir thánaisteacha agus ligfidh sé do na primers ceangail.Mar sin féin, tá struchtúir tánaisteacha fós ag roinnt teimpléid, fiú tar éis dínádúrú teasa.Is féidir aimpliú na dteimpléad deacra seo a dhéanamh ag baint úsáide as ThermoScript Reverse Transcriptase agus an t-imoibriú trascríobh droim ar ais a chur ag teocht níos airde chun aimpliú a fheabhsú.Is féidir le teochtaí gor níos airde sainiúlacht a mhéadú freisin, go háirithe nuair a úsáidtear primers géine-shonracha (GSP) do shintéis cDNA (féach Caibidil 3).Má tá GSP in úsáid agat, cinntigh go bhfuil Tm na bpreamaithe mar an gcéanna leis an teocht goir ionchais.Ná húsáid oligo(dT) agus primers randamach os cionn 60°C.Teastaíonn goir ag 25°C le haghaidh primer randamach ar feadh 10 nóiméad sula méadaítear iad go 60°C.Chomh maith le teocht trascríobh droim ar ais níos airde a úsáid, is féidir sainiúlacht a fheabhsú freisin tríd an meascán RNA/primer a aistriú go díreach ón teocht dínádúraithe 65 ° C go dtí an teocht gor tras-scríofa droim ar ais agus trí mheascán imoibrithe réamh-théamh 2 × (sintéis te cDNA) a chur leis.Cuidíonn an cur chuige seo le cosc ​​a chur ar phéireáil bonn idirmhóilíneach a tharlaíonn ag teochtaí níos ísle.Is féidir an t-athrú teochta iolrach a theastaíonn le haghaidh RT-PCR a shimpliú trí úsáid a bhaint as timthriallach teirmeach.

Feidhmíonn an tth polaiméaráis teirmeastábla mar pholaiméiráis DNA i láthair Mg2+ agus mar pholaiméiráis RNA i láthair Mn2+.Is féidir é a choinneáil te ag uasteocht 65°C.Mar sin féin, laghdaíonn láithreacht Mn2+ le linn PCR dílseacht, rud a fhágann nach bhfuil Tth polymerase chomh hoiriúnach céanna d’aimpliú ardchruinneas, mar chlónáil cDNA.Ina theannta sin, tá éifeachtacht íseal trascríobh droim ar ais ag Tth, rud a laghdaíonn íogaireacht, agus, ós rud é gur féidir trascríobh droim ar ais agus PCR a dhéanamh le haon einsím amháin, ní féidir imoibrithe rialaithe gan trascríobh droim ar ais a úsáid chun táirgí aimplithe cDNA a chur i gcomparáid le DNA géanóm éillithe.Scaradh na táirgí aimpliúcháin.

4. Breiseáin a chuireann trascríobh droim ar ais:

Cuirtear breiseáin lena n-áirítear gliocról agus DMSO leis an imoibriú sintéise chéad-snáithe, a fhéadfaidh cobhsaíocht an tsnáithe dúbailte aigéid núicléigh a laghdú agus struchtúr tánaisteach RNA a dhícheangal.Is féidir suas le 20% gliocról nó 10% DMSO a chur leis gan cur isteach ar ghníomhaíocht SuperScript II nó MMLV.Is féidir le AMV suas le 20% gliocról a fhulaingt freisin gan gníomhaíocht a chailleadh.Chun íogaireacht RT-PCR a uasmhéadú san imoibriú trascríobh droim ar ais SuperScriptⅡ, is féidir gliocról 10% a chur leis agus a ghoradh ag 45 ° C.Má chuirtear 1/10 den táirge imoibriúcháin trascríobh droim ar ais le PCR, ansin tá an tiúchan gliocról san imoibriú aimpliúcháin 0.4%, rud nach leor chun PCR a chosc.

5. RNaseH treat:

Má dhéantar frithghníomhartha sintéise cDNA a chóireáil le RNaseH roimh PCR is féidir íogaireacht a mhéadú.I gcás roinnt teimpléid, ceaptar go gcuireann RNA san imoibriú sintéise cDNA cosc ​​ar tháirgí aimpliúcháin a cheangal, agus sa chás sin is féidir le cóireáil RNaseH íogaireacht a mhéadú.Go ginearálta, tá gá le cóireáil RNaseH nuair a dhéantar sprioc-theimpléid cDNA lánfhad níos faide a aimpliú, mar scherosis tiúbrach II cóip íseal.Maidir leis an teimpléad deacair seo, d'fheabhsaigh cóireáil RNaseH an comhartha a tháirg SuperScript II nó cDNA sintéiseithe AMV.I gcás formhór na n-imoibrithe RT-PCR, tá cóireáil RNaseH roghnach, toisc go hidrealaíonn an chéim dínádúraithe PCR ag 95 ° C an RNA sa choimpléasc RNA:DNA de ghnáth.

6. Modh Braite Beaga RNA a fheabhsú:

Tá RT-PCR go háirithe dúshlánach nuair nach bhfuil ach méideanna beaga RNA ar fáil.Cuidíonn glycogen a chuirtear leis mar iompróir le linn aonrú RNA le táirgeacht samplaí beaga a mhéadú.Is féidir glycogen saor ó RNase a chur leis ag an am céanna le Trizol a chur leis.Tá Glycogen intuaslagtha in uisce agus is féidir é a choinneáil sa chéim uiscí le RNA chun cabhrú le deascadh ina dhiaidh sin.I gcás samplaí níos lú ná 50 mg fíocháin nó 106 cealla saothraithe, is é an tiúchan molta de glycogen saor ó RNase ná 250 μg/ml.

Má chuirtear BSA aicéitilithe leis an imoibriú trascríobh droim ar ais ag baint úsáide as SuperScript II is féidir an íogaireacht a mhéadú, agus le haghaidh méideanna beaga RNA, laghdú ar an méid SuperScript II agus 40 aonad de inhibitor RNaseOut nuclease a chur leis is féidir an leibhéal braite a mhéadú.Má úsáidtear glycogen sa phróiseas leithlisithe RNA, moltar fós BSA nó inhibitor RNase a chur leis nuair a úsáidtear SuperScript II le haghaidh imoibriú trascríobh droim ar ais.

Mar sin féin, sainiúlacht RT-PCR a mhéadú

1. Asintéis CND:

Is féidir sintéis cDNA den chéad snáithe a thionscnamh trí úsáid a bhaint as trí mhodh éagsúla, a mbíonn tionchar ag a sainiúlacht choibhneasta ar mhéid agus ar chineál an cDNA sintéiseithe.

Ba é an modh primer randamach an ceann is lú sonraíochta de na trí mhodh.Cuireann primers anneal ag láithreáin iolracha ar fud na tras-scríbhinne, ag giniúint cDNAs gearr, páirt-fhad.Is minic a úsáidtear an modh seo chun seichimh deiridh 5′ a fháil agus chun cDNA a fháil ó theimpléid RNA le réigiúin de struchtúr tánaisteach nó le suíomhanna foirceanta nach féidir a mhacasamhlú le tras-scríbhinne droim ar ais.Chun an cDNA is faide a fháil, ní mór an cóimheas idir na primers agus RNA i ngach sampla RNA a chinneadh go heimpíreach.Bhí tiúchan tosaigh na bpreiméirí randamacha sa raon ó 50 go 250 ng in aghaidh an 20 μl imoibriúcháin.Ós rud é gur RNA ribosómach go príomha é cDNA atá sintéiseithe ó RNA iomlán ag baint úsáide as primers randamach, roghnaítear polai(A) + RNA mar theimpléad de ghnáth.

Tá primers Oligo(dT) níos sainiúla ná primers randamach.Hibridíonn sé chuig an eireaball polai(A) a fhaightear ag deireadh 3′ an chuid is mó de na mRNAs eucaryotic.Toisc go bhfuil poly(A)+ RNA thart ar 1% go 2% den RNA iomlán, tá méid agus castacht cDNA i bhfad níos lú ná mar a bhíonn le primers randamach.Mar gheall ar a shainiúlacht ard, ní éilíonn oligo(dT) go ginearálta leas iomlán a bhaint as an gcóimheas idir RNA agus primers agus roghnú polai(A)+.Moltar 0.5μg oligo(dT) a úsáid in aghaidh an chórais imoibrithe 20μl.Tá oligo(dT)12-18 oiriúnach don chuid is mó de RT-PCR.Cuireann an Córas ThermoScript RT-PCR oligo(dT)20 ar fáil mar gheall ar a chobhsaíocht theirmeach níos fearr le haghaidh teochtaí goir níos airde.

Is iad primers géine-shonracha (GSP) na priméirí is sainiúla don chéim trascríobh droim ar ais.Is oligonucleotide antisense é GSP atá in ann hibridiú go sonrach leis an seicheamh sprice RNA, murab ionann agus primers randamach nó oligo(dT), a anneal do gach RNA.Baineann na rialacha céanna a úsáidtear chun primers PCR a dhearadh le dearadh GSP in imoibrithe trascríobh droim ar ais.Is féidir leis an GSP a bheith san ord céanna leis an bpriméir aimpliúcháin a aistríonn go dtí an foirceann 3′-is mó den mRNA, nó is féidir an GSP a dhearadh chun an primer aimpliúcháin droim ar ais a anáil le sruth.I gcás roinnt ábhar aimplithe, ní mór níos mó ná primer antisense amháin a dhearadh le haghaidh RT-PCR rathúil toisc go bhféadfadh struchtúr tánaisteach an sprioc-RNA cosc ​​a chur ar cheangal primer.Moltar 1 pmol antisense GSP a úsáid in imoibriú sintéise 20 μl den chéad snáithe.

2. Ardaigh an teocht goir le haghaidh trascríobh droim ar ais:

D'fhonn leas iomlán a bhaint as an mbuntáiste iomlán a bhaineann le sainiúlacht GSP, ba cheart transcriptase droim ar ais le teirmeastatacht níos airde a úsáid.Is féidir tras-scríbhinní droim ar ais teirmeach a ghoradh ag teochtaí níos airde chun déine imoibrithe a mhéadú.Mar shampla, má cheanglaíonn GSP ag 55°C, ní bhainfear leas iomlán as sainiúlacht an GSP má úsáidtear AMV nó M-MLV le haghaidh tras-scríobh droim ar ais ag déine íseal 37°C.Mar sin féin, is féidir SuperScript II agus ThermoScript a imoibriú ag 50 ° C nó níos airde, rud a chuirfidh deireadh le táirgí neamhshonracha a ghintear ag teochtaí níos ísle.Ar mhaithe le sainiúlacht uasta, is féidir an meascán RNA/primer a aistriú go díreach ón teocht dínádúraithe 65°C go dtí an teocht goir trascríobh droim ar ais agus a chur le meascán imoibrithe 2 × réamhthéite (tús te sintéise cDNA).Cuidíonn sé seo le péireáil bonn idirmhóilíneach a chosc ag teochtaí ísle.Is féidir na haistrithe teochta iolracha a theastaíonn le haghaidh RT-PCR a shimpliú trí úsáid a bhaint as timthriallach teirmeach.

3. Laghdaíonn sé éilliú DNA genomic:

Deacracht fhéideartha a bhaineann le RT-PCR is ea éilliú DNA géanómach san RNA.Trí úsáid a bhaint as modh leithlisithe RNA maith, mar shampla Trizol Imoibrí, laghdófar an méid DNA genómach a thruaillíonn an t-ullmhúchán RNA.Chun táirgí a dhíorthaítear ó DNA géanómach a sheachaint, is féidir cóireáil a dhéanamh ar RNA le DNase I de ghrád aimplithe chun DNA éillitheach a bhaint roimh an trascríobh droim ar ais.Cuireadh deireadh le díleá DNase I trí na samplaí a chothú in EDTA 2.0 mM ar feadh 10 nóiméad ag 65°C.Is féidir le EDTA hiain mhaignéisiam a chealú, rud a chosc hidrealú RNA ian-spleách maignéisiam ag teochtaí arda.

D'fhonn cDNA aimplithe a dheighilt ó tháirgí aimplithe DNA géanómacha a éilliú, is féidir priméirí a dhearadh a scarann ​​gach anáil le heasóin.Beidh táirgí PCR a dhíorthaítear ó cDNA níos giorra ná iad siúd a dhíorthaítear ó DNA géanóm éillithe.Ina theannta sin, rinneadh turgnamh rialaithe gan tras-scríobh droim ar ais ar gach teimpléad RNA chun a chinneadh an raibh blúire tugtha díorthaithe ó DNA genomic nó cDNA.Díorthaítear an táirge PCR a fhaightear gan trascríobh droim ar ais ón genome.