Tá gach duine ag caint faoi phrionsabal an turgnaimh qRT-PCR, dearadh primer, léirmhíniú torthaí, etc., ach is dóigh liom gur chóir dom oibriú turgnamhach qRT-PCR a roinnt leat.Tá sé beag, ach tá sé faoi thorthaí.

Sula ndéanaimid qRT-PCR, ní mór dúinn tuiscint shoiléir a bheith againn ar ár modhanna RNA agus oibríochta féin.Tar éis an tsaoil, tá ár n-iarrachtaí dírithe ar thorthaí a fháil, seachas a bheith ag cleachtadh go simplí.Mar sin, sula ndéanaimid qRT-PCR, ní mór dúinn na saincheisteanna seo a leanas a chinneadh (nach bhfuil cuid acu infheidhme ach amháin maidir le SYBR).

1 An bhfuil tú cinnte nach bhfuil do RNA díghrádaithe?

Ní féidir le NanoDrop 2000 ach tiúchan agus íonacht RNA a bhrath, ach ní féidir leis sláine RNA a bhrath.

Is féidir leis an luach RNA (Uimhir Dianachta RNA) sláine an RNA a léiriú, a aimsítear ag an gcóras Agilent 2100 Bioanalyzer.

Fíor. Léaráid scéimreach de luachanna RIN do shamplaí éagsúla RNA (eucaryotes)

Mar sin féin, go ginearálta ní bhíonn Bithanailíseoir Agilent 2100 ag saotharlanna.Sa chás seo, is féidir linn a bhrath trí fhoirmiú formaildéad, ach tá an ceanglas maidir le méid iomlán RNA ard, mar sin is é an modh is tapúla ná gnáth-leictreafóiréis glóthach a úsáid.Ní mór é a bheith i dtimpeallacht saor ó núicléas, mar sin is gá an umar leictreafóiréis, buidéal sol, lúibín glóthach agus cíor a nigh le huisce DEPC.Tá an agarose saor ó núicléas freisin (chomh fada agus a osclaítear go húr é), agus ba cheart an Maolán Luchtaithe a oscailt go úr oiread agus is féidir, le glóthach 1.2%.

Tabhair faoi deara go gcaithfear an glóthach a dhíscaoileadh go hiomlán, ar shlí eile beidh sé ina chúis le bannaí inhomogeneous, mar a thaispeántar i sampla 9 san fhigiúr.Má tá an voltas ró-ard nó ag rith ró-fhada ginfidh sé teas agus cuirfidh sé faoi deara díghrádú RNA, mar sin ba cheart an voltas agus an t-am a rialú go réasúnta.Ina theannta sin, féadann rith glóthach a chinneadh freisin an bhfuil iarmhar DNA sa sampla, agus féachaint an bhfuil líon mór bannaí coinnithe sa tobar dáileacháin.

Fíor.Leictreafóiréis glóthach a bhrath RNA

2 An bhfuil tú cinnte faoi chomhchruinniú do cDNA?

Is é an taithí atá ag na deartháireacha móra sa tsaotharlann ná go bhfuil an cDNA den chóras 20 ul a fhaightear ag gach inbhéartú caolaithe go díreach 20X, agus caolaítear na deirfiúracha iardhochtúireachta 10X.Braitheann mé ar an gcás de ghnáth.Toisc go bhfuil cáilíocht an RNA atá luaite ag gach duine difriúil, tá an leibhéal aisiompaithe difriúil freisin, agus ní fhéadfaidh an teicneolaíocht aisiompaithe a bheith cobhsaí.

Mar sin, gach uair a gheobhaidh mé an cDNA droim ar ais, déanfaidh mé é a chaolú ar dtús thart ar 3 huaire, agus ansin bain úsáid as an ghéine coimeádta chun RT-PCR a dhéanamh, is é líon na dtimthriallta go ginearálta 25 timthriall, chun an tiúchan sonrach a aithint, agus ansin an fachtóir caolúcháin deiridh a chinneadh.

3 An bhfuil tú cinnte go bhfuil do chuid primers éasca le húsáid?

Is féidir leis an cuar leá de qRT-PCR a rith, ach cosnaíonn sé seo airgead fós.I gcás saotharlanna gan a lán airgid, nuair a fhaigheann siad go leor primers, is féidir leo gnáth-RT-PCR a úsáid chun féachaint an bhfuil sé ina bhanna aonair agus sainiúlacht na bpriiméirí a aithint.Mura bhfuil an tsaotharlann gann ar airgead, is féidir sainiúlacht gach primers a aithint uair amháin tríd an gcuar leá.

4 An bhfuil tú cinnte go bhfuil do dhálaí turgnamhacha oiriúnach?

Ba cheart SYBR a chosaint ó sholas láidir, mar sin déan iarracht an solas lastuas a mhúchadh nuair a bhíonn imoibrí SYBR á chur leis, agus ní gá ach solas dim a úsáid chun é a chomhlánú.

Stóráil SYBR ag 4°C.Agus tú in úsáid, déan inbhéartú go réidh suas agus síos chun meascadh go maith chun cúradh a sheachaint, agus ná déan vortex go bríomhar.

Is maith le roinnt deirfiúracha níos óige marcanna a tharraingt ar an mbord PCR ar eagla na samplaí a mheascadh, rud atá mícheart.Toisc gur dócha go mbeidh tionchar ag do mharcóirí ar bhailiú na gcomharthaí fluaraiseacha, molaim go ginearálta do dhaoine sóisearacha leabhair nótaí turgnamhacha a úsáid chun cabhrú leis an gcuimhne, mar a thaispeántar thíos.

Fíor.Léaráid luchtaithe sampla qRT-PCR

5 An bhfuil tú cinnte go bhfuil tú ag déanamh i gceart?

Bí cinnte lámhainní a chaitheamh, lámhainní a chaitheamh, lámhainní a chaitheamh, agus rudaí tábhachtacha a rá trí huaire.

D'fhonn nochtadh SYBR go solas a laghdú, is maith liom go pearsanta teimpléad a chur leis ar dtús, mar a thaispeántar san fhigiúr thíos.De réir na taithí, is dócha go mbeidh earráidí samplála mar thoradh ar líon beag teimpléad a chur leis.Dá bhrí sin, d'fhonn an earráid a dhéantar de bharr méid beag teimpléad a chur leis a íoslaghdú, de ghnáth déanaim an sampla a dhúbailt arís, agus an méid a dhúbailt nuair a bhíonn an sampla á chur leis chun an méid H2O2 a chuirtear leis a laghdú.

Fíor.Léaráid scéimreach de luchtú qRT-PCR

Ansin cumraigh an córas qRT-PCR mar seo a leanas.

Fíor.Léaráid ullmhúcháin córais qRT-PCR

TABHAIR FAOI DEARA: Is gá an próiseas cumraíochta a dhéanamh ar oighear.

Tar éis an sampla a chur leis, greamaigh an scannán séalaithe trédhearcach.Déan iarracht gan teagmháil a dhéanamh le dromchla an scannáin shéalaithe trédhearcach le do lámha, ach oibriú ón spás ar an dá thaobh den scannán.Toisc go bhféadfadh tionchar a bheith ag méarloirg ar bhailiú na gcomharthaí fluaraiseacha freisin.Ansin bain úsáid as lártheifneoir chun lártheifneoir a lárú go tapa ar feadh 10 s ar luas íseal chun an sampla a chosc ó chrochadh ar an mballa.

Táirgí Gaolmhara:

Trealamh Cill Díreach RT-qPCR

RT Éasca II