Tá PCR (imoibriú slabhra polaiméire) ar cheann de na teicneolaíochtaí aimplithe DNA in vitro, le stair níos mó ná 30 bliain.

Rinne Kary Mullis ó Cetus, SAM ceannródaíocht ar theicneolaíocht PCR i 1983. Chuir Mullis iarratas isteach ar phaitinn PCR i 1985 agus d’fhoilsigh sé an chéad pháipéar acadúil PCR ar Eolaíocht an bhliain chéanna.Bronnadh Duais Nobel sa cheimic ar Mullis i 1993 as a chuid oibre.

Bunphrionsabail PCR

Is féidir le PCR blúirí DNA sprice a mhéadú níos mó ná milliún uair.Tá an prionsabal faoi chatalú DNA polymerase, ag baint úsáide as DNA snáithe tuismitheora mar theimpléad agus primer sonrach mar phointe tosaigh le haghaidh síneadh.Déantar é a mhacasamhlú in vitro trí chéimeanna cosúil le dínádúrú, anáil agus síneadh.Comhlánaíonn an próiseas DNA snáithe iníonacha an teimpléad DNA snáithe tuismitheora.

Tá an próiseas caighdeánach PCR roinnte ina thrí chéim:

1.Denaturation: Úsáid teocht ard chun snáitheanna dúbailte DNA a scaradh.Tá an nasc hidrigine idir snáitheanna dúbailte DNA briste ag teocht ard (93-98 ℃).

2.Annealing: Tar éis an DNA dúbailte-snáithe a bheith scartha, ísligh an teocht ionas gur féidir leis an primer ceangal leis an DNA aon-shnáithe.

3. Síneadh: Tosaíonn an DNA polymerase a shintéisiú snáitheanna comhlántacha feadh na snáitheanna DNA ó na primers cheangal nuair a bhíonn an teocht ísliú.Nuair a bhíonn an síneadh críochnaithe, cuirtear timthriall i gcrích, agus déantar líon na blúirí DNA a dhúbailt

Agus na trí chéim seo á gcómhalartú 25-35 uair, méadóidh líon na blúirí DNA go heaspónantúil.

Is é seiftiúlacht PCR gur féidir primers éagsúla a dhearadh le haghaidh spriocghéinte éagsúla, ionas gur féidir blúirí géine sprice a mhéadú laistigh de thréimhse ghearr ama.

Go dtí seo, is féidir PCR a roinnt i dtrí chatagóir, eadhon PCR gnáth, PCR cainníochtúil fluaraiseacha agus PCR digiteach.

An chéad ghlúin de PCR gnáth

Bain úsáid as gnáth-ionstraim aimplithe PCR chun an spriocghéine a aimpliú, agus ansin leictreafóiréis glóthach agarose a úsáid chun an táirge a bhrath, ní féidir ach anailís cháilíochtúil a dhéanamh.

Na príomh-mhíbhuntáistí a bhaineann leis an gcéad ghlúin PCR:

1.Prone le aimpliú neamhshonrach agus torthaí dearfacha bréagacha.

2.Bíonn an bhrath ar feadh i bhfad agus tá an oibríocht achrannach.

3.Ní féidir ach tástáil cháilíochtúil a dhéanamh

PCR Fíor-Ama den dara glúin

Úsáideann Real-Time PCR, ar a dtugtar qPCR freisin, tóireadóirí fluaraiseacha a fhéadfaidh dul chun cinn an chórais imoibrithe a léiriú, agus déanann sé monatóireacht ar charnadh táirgí aimplithe trí chomharthaí fluaraiseacha a charnadh, agus déanann sé breithiúnas ar na torthaí tríd an gcuar fluaraiseachta.Is féidir é a chainníochtú le cabhair ó luach Cq agus cuar caighdeánach.

Toisc go ndéantar an teicneolaíocht qPCR i gcóras dúnta, laghdaítear an dóchúlacht éillithe, agus is féidir monatóireacht a dhéanamh ar an comhartha fluaraiseachta le haghaidh braite cainníochtúil, mar sin is é an ceann is mó a úsáidtear i gcleachtas cliniciúil agus tá sé anois ar an teicneolaíocht ceannasach i PCR.

Is féidir na substaintí fluaraiseacha a úsáidtear i PCR cainníochtúla fluaraiseacha fíor-ama a roinnt ina: taiscéalaí fluaraiseacha TaqMan, rabhcháin mhóilíneacha agus dath fluaraiseacha.

1) taiscéalaí fluaraiseacha TaqMan:

Le linn aimplithe PCR, cuirtear taiscéalaí fluaraiseachta ar leith leis agus péire primer á chur leis.Is oligonucleotide é an taiscéalaí, agus déantar an dá chríoch a lipéadú le grúpa fluaraiseachta tuairisceora agus grúpa fluaraiseachta quencher.

Nuair a bhíonn an taiscéalaí slán, déanann an grúpa múchadh an comhartha fluaraiseacha a astaíonn an grúpa tuairisceoirí a ionsú;Le linn aimpliú PCR, scoilteann agus díghrádaíonn gníomhaíocht exonuclease 5′-3′ an einsím Taq an taiscéalaí, rud a fhágann go bhfuil an grúpa fluaraiseachta tuairisceora agus an mhúchadh Tá an grúpa fluaraiseachta scartha, ionas gur féidir leis an gcóras monatóireachta fluaraiseachta an comhartha fluaraiseachta a fháil, is é sin, gach uair a dhéantar snáithe DNA a mhéadú go hiomlán, déantar an comhartha fluaraiseachta a mhéadú go hiomlán agus an comhartha fluaraiseachta a mhéadú go hiomlán, déantar an comhartha fluaraiseachta a mhéadú go hiomlán agus an comhartha fluaraiseachta a mhéadú go hiomlán. le foirmiú an táirge PCR.

2) Dath fluaraiseacha SYBR:

Sa chóras imoibrithe PCR, cuirtear farasbarr de lí fluaraiseacha SYBR leis.Tar éis an dath fluaraiseacha SYBR a ionchorprú go neamh-sonrach sa snáithe dúbailte DNA, astaíonn sé comhartha fluaraiseacha.Ní scaoilfidh an móilín lí SYBR nach bhfuil ionchorpraithe sa slabhra aon chomhartha fluaraiseacha, rud a chinnteoidh an comhartha fluaraiseacha Tá an méadú ar tháirgí PCR sioncronaithe go hiomlán leis an méadú ar tháirgí PCR.Ní cheanglaíonn SYBR ach le DNA dúbailte-shnáithe, mar sin is féidir an cuar leá a úsáid chun a chinneadh an bhfuil imoibriú PCR sonrach.

3) Beacon mhóilíneach:

Is taiscéalaí oligonucleotide dúbailte-lipéadaithe é a fhoirmíonn struchtúr bioráin ghruaige de thart ar 8 mbonn ag na foircinn 5 agus 3.Déantar na sraitheanna aigéid núicléigh ag an dá cheann a phéireáil go comhlántach, rud a fhágann go bhfuil an grúpa fluaraiseacha agus an grúpa múchadh daingean.Dún, ní dhéanfar aon fhluaraiseacht a tháirgeadh.

Tar éis an táirge PCR a ghiniúint, le linn an phróisis annealing, déantar an chuid lár den beacon mhóilíneach a phéireáil le seicheamh DNA ar leith, agus tá an ghéine fluaraiseacha scartha ón géine quencher chun fluaraiseacht a tháirgeadh.

Na príomh-mhíbhuntáistí a bhaineann le PCR den dara glúin:

Tá an íogaireacht fós in easnamh, agus tá braite eiseamail ísealchóipe míchruinn.

Tá tionchar an luach cúlra, agus tá an toradh a oirfeadh do chur isteach.

Nuair a bhíonn coscóirí PCR sa chóras imoibrithe, tá na torthaí braite so-ghabhálach do chur isteach.

PCR digiteach tríú glúin

Ríomhann Digiteach PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) uimhir chóip an tseichimh sprice trí bhrath críochphointe, agus féadann sé fíorbhrath cainníochtúil cruinn a dhéanamh gan úsáid a bhaint as rialuithe inmheánacha agus cuair chaighdeánacha.

Úsáideann PCR digiteach braite críochphointe agus níl sé ag brath ar an luach Ct (tairseach timthriall), agus mar sin is lú an tionchar a bhíonn ag an imoibriú PCR digiteach ar an éifeachtúlacht aimpliúcháin, agus tá an lamháltas d'inhibitors imoibrithe PCR feabhsaithe, le cruinneas ard agus in-atáirgtheacht.

Mar gheall ar shaintréithe íogaireacht ard agus cruinneas ard, ní chuirtear isteach go héasca ar choscóirí imoibrithe PCR, agus is féidir leis fíor-chainníochtú iomlán a bhaint amach gan táirgí caighdeánacha, rud a tháinig chun bheith ina hotspot taighde agus iarratais.

De réir foirmeacha éagsúla an aonaid imoibrithe, is féidir é a roinnt ina thrí phríomhchineál: córais microfluidic, sliseanna agus droplet.

1) PCR digiteach micreasreabhach, mdPCR:

Bunaithe ar an teicneolaíocht microfluidic, tá an teimpléad DNA scartha.Is féidir leis an teicneolaíocht microfluidic an nana-uasghrádú samplach nó giniúint braoiníní níos lú a bhaint amach, ach tá modh asaithe speisialta ag teastáil ó na braoiníní agus ansin iad a chomhcheangal leis an gcóras imoibrithe PCR.Tá mdPCR glactha de réir a chéile trí mhodhanna eile athsholáthair.

2) PCR digiteach bunaithe ar droplet, ddPCR:

Bain úsáid as teicneolaíocht giniúna braoiníní uisce-in-ola chun an sampla a phróiseáil ina bhraoiníní, agus roinn an córas imoibrithe ina bhfuil móilíní aigéid núicléigh ina mílte braoiníní nanascála, nach bhfuil an sprioc-mhóilín aigéid núicléigh i ngach ceann acu le braiteadh, nó ina bhfuil ceann amháin do roinnt móilíní aigéid núicléigh le tástáil.

3) PCR digiteach sliseanna-bhunaithe, cdPCR:

Bain úsáid as an teicneolaíocht cosán sreabhán comhtháite chun go leor micreafheadáin agus microcavities a ghreanadh ar sliseoga sileacain nó gloine Grianchloch, agus sreabhadh an réitigh a rialú trí chomhlaí rialaithe éagsúla, agus an leacht samplach a roinnt ina nanaiméadar den mhéid céanna isteach sna toibreacha imoibrithe le haghaidh Imoibriú PCR digiteach chun cainníochtú iomlán a bhaint amach.

Na príomh-mhíbhuntáistí a bhaineann leis an tríú glúin PCR:

Tá an trealamh agus na himoibrithe costasach.

Tá na ceanglais cháilíochta teimpléid ard.Má tá cainníocht an teimpléid níos mó ná an chainníocht micreachórais, beidh sé dodhéanta a chainníochtú, agus má tá sé ró-bheag, laghdófar an cruinneas cainníochtaithe.

Is féidir dearfacha bréagacha a ghiniúint freisin nuair a bhíonn aimpliú neamhshonrach ann.