PCR, iolra PCR, PCR in situ, PCR droim ar ais, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Déanfaimid réiteach ar choincheapa, céimeanna agus sonraí PCR éagsúla

Ⅰ. PCR

Is teicneolaíocht mhóilíneach bitheolaíoch é Imoibriú Slabhra Polymerase, dá ngairtear PCR, a úsáidtear chun blúirí DNA sonracha a mhéadú.Is féidir é a mheas mar mhacasamhlú DNA speisialta in vitro.Thángthas ar DNA polymerase (DNA Polymerase I) chomh luath le 1955, agus Klenow Fragment of E. Coli, a bhfuil luach turgnamhach agus praiticiúlacht, fuair an Dr H. Klenow go luath sna 1970í, ach toisc nach bhfuil an einsím fhulaingt teocht, is féidir le teocht ard degenerate é, mar sin ní chomhlíonann sé an imoibriú slabhra degeneration polymerase le teocht ard.Rinneadh na heinsímí atá in úsáid inniu (ar a dtugtar Taq polymerase), a leithlisiú ó Thermus aquaticus, baictéar earrach te i 1976. Is é an saintréith atá aige ná gur féidir leis teocht ard a sheasamh agus is einsím idéalach é, ach úsáidtear go forleathan é tar éis na 1980í.Tá coincheap bunaidh an fhréamhshamhail bunaidh primitive de PCR cosúil le deisiú agus cóipeáil géine, a mhol an Dr KJell Kleppe i 1971. D'fhoilsigh sé an chéad chóip géine simplí agus gearrthéarmach (cosúil leis an gcéad dhá imoibriú timthriall de PCR).D'fhorbair an Dr. Kary B. Mullis an PCR a forbraíodh inniu i 1983. D'fhreastail an Dr. Mullis ar chuideachtaí Corpoideachais an bhliain sin, agus mar sin tá stádas speisialta ag Corpoideachas sa tionscal PCR.D'fhoilsigh an Dr. Mullis an chéad pháipéar gaolmhar le Saiki agus le daoine eile go hoifigiúil i 1985. Ó shin i leith, tá úsáid PCR na mílte míle in aghaidh an lae, agus is féidir a rá go bhfuil go leor modhanna taighde eile neamhbhlasta ar cháilíocht na bpáipéar gaolmhar.Ina dhiaidh sin, úsáidtear teicneolaíocht PCR go forleathan i dtaighde eolaíoch bitheolaíoch agus iarratais chliniciúla, ag éirí mar an teicneolaíocht is tábhachtaí maidir le taighde bitheolaíochta mhóilíneach.Bhuaigh Mullis Duais Nobel sa Cheimic 1993 freisin.

PCRPrionsabal

Tá bunphrionsabal na teicneolaíochta PCR cosúil leis an bpróiseas macasamhlaithe nádúrtha DNA, agus braitheann a shainiúlacht ar an primer oligonucleotide atá comhlántach le dhá cheann an tseichimh sprice.Tá PCR comhdhéanta de thrí chéim bhunúsacha imoibrithe degeneration-annealing-sínte: ① Degeneration DNA teimpléad: Tar éis an DNA teimpléad a théamh go dtí thart ar 93 ° C ar feadh tréimhse áirithe ama, an tuaslagán DNA dé don DNA dé-slabhra a foirmíodh ag an aimpliú PCR ar an teimpléad DNA Fágála, déan slabhra aonair é ionas gur féidir é a chomhcheangal leis an gcéad bhabhta eile chun ullmhú don chéad bhabhta eile.②An anáil (comhdhúil) den teimpléad DNA agus an primer: Tar éis an teimpléad DNA a théamh agus a dhíghiniú ina slabhra amháin, titeann an teocht go dtí thart ar 55°C.Seicheamh comhlántach an primer agus an teimpléid DNA aonshlabhra.③ Síneadh an primer: teimpléad DNA-tá an primer ceangailteach bunaithe ar ghníomh TaqDNA polymerase, le dNTP mar amhábhar imoibriúcháin.Coinnigh prionsabal an mhacasamhlú, déan cóipshlabhra leath-choimeád nua a shintéisiú a chomhlánaíonn an slabhra DNA teimpléid, agus is féidir le próiseas díghiniúna-annealing-síneadh trí thimthriall arís níos mó “cóipshlabhra leath-choimeádta” a fháil, agus tá an slabhra nua seo ar fáil arís Bí mar theimpléad don chéad timthriall eile.Tógann sé 2-4min chun an lúb a chríochnú, is féidir an spriocghéine a mhéadú roinnt milliún uair i 2-3 uair an chloig.

CaighdeánPCRCóras Imoibrithe

Cúig eilimint d'imoibriú PCR

Tá cúig chineál substaintí den chuid is mó i gceist in imoibriú PCR, eadhon primer, einsím, dNTP, teimpléad agus maolán (tá gá le Mg2+).[nós imeachta PCR]

Tá an próiseas caighdeánach PCR roinnte ina thrí chéim

1. Díghiniúint DNA (90°C-96°C): Teimpléid DNA déshlabhra faoi ghníomh teirmeach, briseann bannaí hidrigine, a fhoirmíonn DNA aon slabhra.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Laghdaítear teocht an chórais, cuirtear an primer le chéile leis an teimpléad DNA chun déshlabhra áitiúil a chruthú.

3. Síneadh (70 ℃ -75 ℃): Faoi ghníomh Taq einsím (thart ar 72 ° C, an ghníomhaíocht is fearr), dNTP a úsáidtear mar amhábhar, a leathnú ó dheireadh 5′ an primer → 3′ deireadh, sintéise agus teimpléad chomhlánú a chéile slabhra DNA.

Déantar gach timthriall a dhínádúrú, a anáil agus a shíneadh, ag dúbailt an ábhair DNA.Faoi láthair, mar gheall ar an limistéar aimplithe gearr, is féidir roinnt PCR a mhacasamhlú in am an-ghearr fiú mura bhfuil an ghníomhaíocht einsím Taq optamach, ionas gur féidir é a athrú go dhá chéim, is é sin, is féidir an annealing agus an síneadh a dhéanamh ag 60 ° C-65 ° C ag an am céanna.D'fhonn an próiseas ardaithe agus fuaraithe a laghdú agus an luas freagartha a fheabhsú.

Gnéithe imoibrithe PCR

● Ard-Sonraíocht

Is iad seo a leanas fachtóirí cinntitheacha an fhreagra PCR: ①An teaglaim shonrach den primer agus an teimpléad DNA.② Prionsabal na péireála bonn.③ Dílseacht imoibriú sintéise polaiméaráis TaqDNA.④ Sainiúlacht agus coimeádach na sprice géine.

Is é an meascán ceart de primers agus teimpléid an eochair.Tá ceangailteach an primer agus an teimpléad agus síneadh an slabhra primer bunaithe ar phrionsabal an mheaitseála bonn alcaileach.Is féidir dílseacht imoibrithe sintéise polymerase agus friotaíocht ard teochta an DNA Taq polymerase chun ceangailteach (comhdhúil) an teimpléid agus an primer san imoibriú a dhéanamh ag teocht níos airde.Méadaítear sainiúlacht an teaglaim go mór.Is féidir leis an gearrthóg ardchruinneas a choinneáil.Trí sprioc-réigiún géiniteach a roghnú le coimeádach ard agus coimeádach ard, tá a shainiúlacht níos airde.

● Ard-Íogaireacht

Méadaítear méid táirgeachta táirgí PCR de réir innéacs, ar féidir leis an teimpléad tosaigh Picker (PG = 10-12) a leathnú chun leibhéal an mhicririaltóra a mhéadú go dtí leibhéal na microgram (μg = -6).Is féidir spriocchealla a bhrath ó 1 milliún cealla;maidir le víris a bhrath, is féidir le híogaireacht PCR 3 RFU a bhaint amach (aonaid fhoirmithe spotaí folamh);is é 3 bhaictéar an ráta braite íosta san eolaíocht bhaictéarach.

● Simplí agus Fast

Úsáideann an machnamh PCR ard-teocht Taq DNA polymerase, a chuireann an réiteach imoibrithe ag aon am amháin, is é sin, imoibriú degeneration-anneal-síneadh ar an réiteach aimpliú DNA agus pota folctha uisce.Go ginearálta, críochnaítear an t-imoibriú aimpliúcháin i 2 go 4 uair an chloig.Go ginearálta déantar anailís ar tháirgí méadaithe ag claíomh leictreach, agus ní gá iseatóip a úsáid, gan aon truailliú radaighníomhach, agus cur chun cinn éasca.

● Tá íonacht an eiseamail íseal

Ní gá víris nó baictéir agus cealla cultúir a scaradh.Is féidir táirgí amhola DNA agus RNA a úsáid mar aimplitheoirí.Is féidir brath aimpliúcháin DNA a úsáid go díreach trí úsáid a bhaint as eiseamail chliniciúla mar fhuil, leacht coirp, leacht níocháin cough, gruaig, cealla, agus fíocháin bheo.

PCRfadhbanna coitianta

● Diúltach bréagach, gan aon bhannaí aimplithe

Áirítear ar phríomhchéimeanna an imoibrithe PCR: ① ullmhú aigéid núicléacha teimpléid, ② cáilíocht agus sainiúlacht na primers, ③ cáilíocht na n-einsímí ④ coinníollacha timthriall PCR.Ba cheart freisin anailís agus staidéar a dhéanamh ar aimsiú na cúise do na naisc thuas.

Teimpléid: ① Tá próitéin ilghnéitheach sa teimpléad, ② Tá inhibitor einsím Taq sa teimpléad, ③ Níl an próitéin sa teimpléad a dhíchur, go háirithe an próitéin grúpa sa chrómasóim.⑤ Níl díghiniúint aigéad núicléach Deminer críochnúil.Nuair a bhíonn cáilíocht na n-einsímí agus na primers go maith, níl aon bhanna aimpliúcháin ann, agus is dóichí go ndéantar cóireáil díleácha ar eiseamail.Tá rud éigin cearr leis an bpróiseas eastóscadh aigéad núicléach teimpléad, mar sin chun réiteach éifeachtach agus cobhsaí díleá a ullmhú, ba cheart a nós imeachta a shocrú agus gan a athrú go treallach.

Díghníomhú einsím: ba cheart einsím nua nó einsímí sean agus nua a úsáid le chéile chun anailís a dhéanamh an bhfuil gníomhaíocht na heinsíme caillte nó neamhleor, rud a fhágann claonchlónna bréagacha.Ba chóir a thabhairt faoi deara go ndéantar dearmad uaireanta ar einsím Taq nó bróimíd ethidium.

Primer: cáilíocht an primer, tiúchan an primer, agus cibé an bhfuil tiúchan an dá primer siméadrach.Is cúis choitianta é an teip PCR nó nach bhfuil an banna méadaithe idéalach agus seans maith go idirleata.Tá fadhbanna le caighdeán na primers de roinnt uimhreacha bhaisc.Tá tiúchan ard agus tiúchan íseal ag an dá primers, rud is cúis le aimpliú neamhshiméadrach íseal-éifeachtúlachta.Is iad na frithbhearta ná: ① Roghnaigh primer maith chun aonaid a shintéisiú.② Braitheann tiúchan an primer ní hamháin ar an luach OD, ach tugann sé aird freisin ar leacht bunaidh an primer chun leictreafóiréis glóthach agar siúcra a dhéanamh.Ní mór go mbeadh crios stiall primer ann, agus ba cheart go mbeadh gile an dá primer comhsheasmhach go ginearálta.Féadfaidh crios, PCR theipeann ag an am seo, agus ba cheart é a réiteach leis an aonad sintéise primer.Má tá primer ard, tá an gile íseal, agus ní mór a thiúchan a chothromú nuair a chaolaítear é.③ Ba cheart an primer a íoc agus a stóráil ag tiúchan ard chun cosc ​​a chur ar il-reo nó codanna cuisniúcháin fadtéarmacha den chuisneoir, rud a fhágann go dtiocfaidh meath ar an primer agus go díghrádóidh sé.④ Tá dearadh an primer míréasúnta, mar nach leor fad an primer, agus cruthaítear an di braisle idir na primers.

Mg2+ tiúchan: Tá tionchar mór ag tiúchan ian Mg2+ ar éifeachtúlacht aimplithe PCR.Is féidir le tiúchan iomarcach laghdú a dhéanamh ar ghnéas eile aimpliú PCR.Má tá an tiúchan ró-íseal, déanfaidh an t-aschur aimplithe PCR fiú an teip aimpliúcháin PCR gan an banna leathnaithe.

Athrú toirte imoibrithe: Is é an méid a úsáidtear in aimpliú PCR ná 20ul, 30ul, agus 50ul nó 100uL, socraítear líon mór an iarratais ar aimpliú PCR de réir críocha éagsúla taighde eolaíoch agus tástála cliniciúla.Tar éis méideanna beaga a dhéanamh mar 20ul, is gá coinníoll corda a dhéanamh nuair a bhíonn an méid á dhéanamh, ar shlí eile beidh sé theipeann.

Cúiseanna fisiceacha: Tá an claochlú an-tábhachtach le haghaidh aimpliú PCR.Má tá an teocht degeneration íseal, tá an t-am degeneration gearr, is dócha go dtarlóidh sé i claonchlónna bréagach;is féidir le teocht anáil ró-íseal a bheith ina chúis le aimpliú neamhshonrach agus laghdaítear éifeachtúlacht aimplithe sonrach.Tionchar mór ar an meascán de primers agus teimpléid chun éifeachtacht aimplithe PCR a laghdú.Uaireanta is gá teirmiméadair chaighdeánacha a úsáid chun an éagsúlacht, an teocht annealing agus an teocht leathnaithe a bhrath sa chócaire síneadh nó intuaslagtha in uisce, atá ar cheann de na cúiseanna le teip an PCR.

Athraitheacha seicheamh sprice: Má tharlaíonn an seicheamh sprice, sóchán nó scriosadh, cuirtear an fhréamhshamhail agus an teimpléad le chéile, nó mar gheall ar easpa seicheamh sprice, caillfidh an primer agus an teimpléad an t-ord comhlántach, agus ní bheidh a aimpliú PCR rathúil.

● Dearfach bréagach

Is cosúil go bhfuil banna aimpliúcháin PCR comhsheasmhach leis an mbanda seicheamh sprioc, agus uaireanta tá a bhanna níos néata agus níos airde.

Níl an dearadh primer oiriúnach: tá homalógach ag an seicheamh aimpliúcháin roghnaithe agus an seicheamh aimpliúcháin neamhchuspóireach, agus mar sin nuair a bhíonn aimpliú PCR, is seichimh neamhchuspóireacha iad na táirgí PCR aimplithe.Tá an seicheamh sprice ró-ghearr nó tá an primer ró-ghearr, agus tá seans maith ann go dearfach bréagach.Is gá a athdhearadh.

Tras-thruailliú seicheamh sprice nó táirgí aimplithe: Tá dhá chúis leis an truailliú seo: Ar an gcéad dul síos, tras-thruailliú an ghéanóim ar fad nó na codanna móra, rud a fhágann go bhfuil dearfach bréagach ann.Is féidir an cineál dearfach bréagach seo a réiteach trí na modhanna seo a leanas: Bí cúramach agus milis le linn oibriú chun an seicheamh sprice a chosc ó ionanálú isteach sa gunna samplach nó splancadh amach as an bhfeadán lártheifeacha.Seachas einsímí agus substaintí nach féidir leo teochtaí arda a sheasamh, ba cheart gach imoibrí nó trealamh a dhíghalrú le brú ard.Ba cheart na píopaí lártheifeacha agus na samplaí a úsáid ag aon am amháin.Nuair is gá, sula gcuirtear eiseamail leis, nochtar an feadán imoibrithe agus an t-imoibrí do ghhathanna ultraivialait chun an t-aigéad núicléach atá ann cheana féin a scriosadh.Dara, blúirí beaga sa truailliú aeir.Tá na blúirí beaga seo níos giorra ná an seicheamh sprice, ach tá homaleolaíocht áirithe acu.Is féidir é a spliced ​​lena chéile.Tar éis na primers a chomhlánú, is féidir an táirge PCR a leathnú, rud a fhágann go mbeidh táirgeadh dearfach bréagach.Is féidir é a úsáid chun modh PCR nead a laghdú nó a dhíchur.

● Le feiceáil banna aimpliúcháin nonspecific

Tá na bannaí a bhí le feiceáil tar éis aimplithe PCR ar neamhréir leis an méid a bhfuiltear ag súil leis, nó mór nó beag, nó ag an am céanna, nó ag an am céanna, bannaí aimpliúcháin sonracha agus bannaí aimpliúcháin neamhshonracha.Is é teacht chun cinn bannaí neamhshonracha ná: Ar dtús, tá na primers neamhiomlán comhlántach leis an seicheamh sprice, nó polaiméiriú an primer chun di braisle a dhéanamh.Is é an dara ceann ná go bhfuil tiúchan na n-ian MG2 + ró-ard, go bhfuil an teocht annealing ró-íseal, agus go bhfuil baint ag líon na dtimthriallta PCR.Ar an dara dul síos, cáilíocht agus méid na n-einsímí.Go minic, tá einsímí de roinnt foinsí seans maith le bannaí neamhspeisialta agus ní tharlaíonn einsímí na foinse eile.Uaireanta tarlaíonn aimpliú neamh-shonrach ar einsímí freisin.Is iad na frithbhearta ná: earraí tarraingteacha a athdhearadh más gá.Laghdaigh méid na heinsíme nó cuir foinse eile in ionad an einsím.Laghdaigh an méid bunscoile, méadú ar an méid teimpléid go cuí, agus laghdaigh líon na dtimthriallta.Méadaigh an teocht annealaithe i gceart nó bain úsáid as an modh dhá phointe teochta (93 ° C degeneration, annealing agus síneadh ag thart ar 65 ° C).

● Barrach calógach nó téip smearaidh le feiceáil

Uaireanta is cosúil go gcuirtear aimpliú PCR i bhfeidhm nó go bhfuil sliogán nó crios cosúil le cairpéad air.Ar an gcúis, mar gheall ar an méid iomarcach einsímí nó droch-chaighdeán an einsím, tá an tiúchan dNTP ró-ard, tá an tiúchan Mg2+ ró-ard, tá an teocht annealing ró-íseal, agus tá líon na dtimthriallta i bhfad ró.Is iad na frithbhearta ná: ① Laghdaigh méid na n-einsímí, nó athraigh an einsím foinse eile.② Laghdaigh an tiúchan dNTP ③ Laghdaigh tiúchan Mg2+ i gceart.④ Méadú ar chainníocht na teimpléid agus laghdaigh líon na dtimthriallta.

Táirgí Gaolmhara

Laoch PCR (With Dye)

◮ Fidelity níos airde: 6 huaire níos mó ná an gnáth-einsím Taq;

◮ Luas aimpliúcháin níos tapúla

◮ Níos mó inoiriúnaitheachta teimpléid

◮ Éifeachtúlacht aimpliúcháin níos airde

◮ Tá lamháltas comhshaoil ​​níos láidre: suite ag 37 ° C ar feadh seachtaine, ag cothabháil níos mó ná 90% de ghníomhaíocht;

◮ Tá gníomhaíocht pholaiméiráis DNA 5'→3' aige agus gníomhaíocht e-núicléas 5'→3', gan aon ghníomhaíocht exonuclease 3'→5'.

PCR Easy (Le Dye)

Mar gheall ar an gcóras imoibrithe uathúil agus ard-éifeachtúlacht Taq DNA Polymerase tá éifeachtacht aimplithe, sainiúlacht agus íogaireacht níos airde ag imoibriú PCR.

RT-qPCR Easy (Céim a hAon) - SYBR Green I

◮ Déanann trealamh aonchéime tras-scríobh droim ar ais agus qPCR dhá imoibriú san fheadán céanna, ní gá ach teimpléad RNA, primers PCR ar leith agus ddH saor ó RNase a chur leis₂O.

◮ Is féidir leis an trealamh anailís chainníochtúil a dhéanamh go tapa agus go héifeachtúil ar RNA víreasach nó ar RNA a rianú.

◮ Úsáideann an trealamh imoibrí trascríobh droim ar ais Foregene uathúil agus Polymerase DNA Foregene HotStar Taq in éineacht le córas imoibrithe uathúil chun éifeachtacht aimplithe agus sainiúlacht an imoibrithe a fheabhsú go héifeachtach.

◮ Déanann an córas imoibrithe optamaithe go bhfuil íogaireacht braite níos airde, cobhsaíocht theirmeach níos láidre, agus caoinfhulaingt níos fearr ag an imoibriú.

◮ RT-qPCR Éasca^TM(Céim a hAon) -Tagann trealamh SYBR Green I le dath tagartha inmheánach ROX, ar féidir a úsáid chun deireadh a chur le cúlra comhartha agus earráidí comhartha idir toibreacha, atá áisiúil do chustaiméirí a úsáid i múnlaí éagsúla ionstraimí PCR cainníochtúla.

RT Éasca^TMII (Master Premix le haghaidh sintéis cDNA den chéad snáithe le haghaidhPCR Fíor-ama)

-Cumas éifeachtach chun gDNA a bhaint, is féidir a bhaint as gDNA sa teimpléad laistigh de 2 nóiméad.

-Córas trascríobh droim ar ais éifeachtach, ní thógann sé ach 15 nóiméad chun sintéis an chéad snáithe cDNA a chríochnú.

-Teimpléid choimpléasc: is féidir teimpléid le hábhar ard GC agus struchtúr tánaisteach casta a aisiompú freisin le héifeachtacht ard.

-Córas trascríobh droim ar ais ard-íogaireachta, is féidir le teimpléid leibhéal lch cDNA ardcháilíochta a fháil freisin.

-Tá cobhsaíocht teirmeach ard ag an gcóras trascríobh droim ar ais, is é 42 ℃ an teocht imoibrithe is fearr, agus tá dea-fheidhmíocht trascríobh droim ar ais fós ag 50 ℃.