Is é RT-qPCR an turgnamh bunúsach ar bhitheolaíocht mhóilíneach, agus ní mór do gach duine a bheith eolach air.Áiríonn sé go príomha trí chéim: eastóscadh RNA, trascríobh droim ar ais go cDNA, agus PCR cainníochtúla fluaraiseacha fíor-ama.Ní chabhraíonn sé, cad atá ar siúl?Is dócha go bhfuil fadhb ann lean turgnamh trascríobh droim ar ais!Cé gur cosúil go bhfuil gá leis an turgnamh trascríobh droim ar ais ach a chur leis RNA, dNTP, primers, agustrascríobh droim ar aischuig an feadán lártheifneoir agus a mheascadh go maith, ach sa phróiseas oibríochta iarbhír, tá go leor sonraí fós ann ar gá aird a thabhairt orthu.A ligean ar foghlaim faoi!

Conas cáilíocht RNA a mheas?
Chun cDNA a fháil, tá cáilíocht RNA ríthábhachtach!Is féidir cáilíocht RNA a bhrath go príomha ó dhá ghné:
(1) sláine RNA:Is féidir sláine RNA a fhíorú le leictreafóiréis glóthach agarose. Ag glacadh le eukaryotes mar shampla, tá trí bhanda soiléire ag an RNA iomlán iomlán, is iad na meáchain mhóilíneacha ó mhór go beag ná 28S, 18S, agus 5S, agus tá 28S dhá uair chomh geal le 18S;más féidir trí bhanda a fheiceáil, ach tá an cineál banna doiléir nó ciallaíonn Idirleathadh go bhfuil an RNA díghrádaithe go páirteach.Ag an am seo, déan an t-imoibriú trascríobh droim ar ais láithreach le do thoil agus cuir leis an ionchur teimpléid go cuí;más rud é nach féidir ach banna le meáchan móilíneach beag nó gan aon bhanna a fheiceáil, tá an RNA díghrádaithe go hiomlán agus ní mór é a ath-eastóscadh.Léiríonn Agilent 2100 sláine RNA le buaic-léaráid agus luach RIN.Má tá an t-aigéad núicléach slán, tá bunlíne an electropherogram cothrom;má tá an t-aigéad núicléach díghrádaithe go mór, tá an bunlíne míchothrom agus tá níos mó buaic díghrádaithe le feiceáil;Léiríonn luach RIN sláine an RNA, laistigh den raon 0-10, is mó an luach, is amhlaidh is fearr cáilíocht an RNA.Bhuel, dá airde an leibhéal iomláine.
(2) Íonacht RNA:Is féidir an cóimheas OD260/280 a bhrath le speictreafótaiméadracht UV.Má tá an cóimheas OD260/280 idir 1.9 agus 2.1, tá an íonacht an-mhaith.
Is féidir torthaí cainníochtúla míchruinn a bheith mar thoradh ar DNA géanóm iarmharach
Nuair a bhaintear RNA, féadfar an RNA a fhaighimid a mheascadh le DNA géanómach (gDNA) nach bhfuil glanta.Mar sin, déanfar an cDNA tar éis trascríobh droim ar ais a mheascadh legDNA.Le linn an sruthqPCRimoibriú,cDNAagus féadfar gDNA a aimpliú go comhuaineach, rud a fhágann go mbeidh luach CT sách beag ann, agus mar sin d’fhéadfadh na torthaí a bheith claonta.
Mar sin cad ba cheart dúinn a dhéanamh sa chás seo?Eachtrannachmolann:
(1) Glanadh genome a dhéanamh ar an RNA droim ar ais, is féidir a bhaint trí eastóscadh colún le linn eastóscadh RNA;
(2) Déan an RNA a bhaintear a chóireáil le DNAI , ach é a fhoirceannadh le EDTA;
imoibrithe trascríobh droim ar aisle modúil imréitigh genome;

Conas primers a roghnú le haghaidh trascríobh droim ar ais?
Bíonn tionchar ag primers trascríobh droim ar ais freisin ar thoradh an imoibrithe trascríobh droim ar ais.Is féidir leat primers randamach, Oligo dT nó primers géine-shonracha a roghnú le haghaidh tras-scríobh droim ar ais de réir imthosca sonracha an turgnaimh:
(1) Athscríbhinní sonracha: moltar primers géine-shonracha;
(2) Athscríbhinní blúire fada: moltar priméirí a bhaineann go sonrach le Oligo dT/géine;
(3) Blúirí inmheánacha de thras-scríbhinní fad-deighleog: primers géine-shonracha/ primers randamach / primers randamach + Oligo dT.Má dhéantar an turgnamh qPCR ina dhiaidh sin, ní féidir Oligo dT a úsáid leis féin, mar go bhféadfadh sé go mbeadh claonadh deiridh 3′ 3′ ag baint úsáide as Oligo dT amháin, rud a fhágann go mbeidh torthaí míchearta ar thurgnaimh qPCR;
(4) miRNA: Is féidir primers gas-lúb nó primers fuíll a úsáid.

Cé mhéad uair ar chóir an táirge tras-scríofa droim ar ais cDNA a chaolú lena chainníochtú?
Tar éis cDNA an táirge trascríobh droim ar ais a fháil, tá sé an-tábhachtach cé mhéad uair ba chóir an cDNA a chaolú le haghaidh turgnaimh qPCR.Má tá an tiúchan cDNA ró-ard nó ró-íseal, féadfar difear a dhéanamh don éifeachtúlacht aimplithe.An féidir an tiúchan cDNA a thomhas, agus conas ba cheart é a dhéanamh?
(1) Ní féidir tiúchan cDNA an táirge trascríobh droim ar ais a thomhas, mar i dteannta leis an táirge cDNA, tá Maolán iarmharach trascríobh droim ar ais, transcriptase droim ar ais, primers, etc., sa táirge trascríobh droim ar ais freisin, a chuirfidh isteach ar thorthaí tomhais tiúchana agus ina chúis le cóimheas OD260/280, OD260/230 neamhghnácha agus mar sin ní léiríonn sé fíor-chóimheas cDNA.Ag an am seo, déarfaidh roinnt cairde, ansin déanfaidh mé an tiúchan a thomhas tar éis íonú;anseo, ba mhaith le Foregene a mheabhrú nach moltar an cDNA a íonú, toisc go bhfuil fad an cDNA a fhaightear tríd an aisiompú difriúil, agus caillfear an cDNA gearr san íonú.
(2) Cad atá le déanamh mar sin?Roimh an turgnamh qPCR, is féidir grádán caolaithe an cDNA a chinneadh tríd an réamh-turgnamh .Mar shampla: bain úsáid as réiteach stoc cDNA, caolú 10-huaire, agus caolú 100-huaire mar theimpléid le haghaidh turgnaimh qPCR, agus roghnaigh an fachtóir caolaithe le luach CT sa raon 18-28.

Cén chaoi ar cheart miRNAs a thrascríobh droim ar ais?
Is RNA móilín beag aon-shnáithe é miRNA le méid thart ar 22 nt nach gcódaíonn próitéin.Mar gheall ar a fhad gearr, is deacair an modh traidisiúnta qPCR a chainníochtú go díreach, mar sin is minic is gá miRNA a leathnú;Áirítear ar na modhanna trascríobh droim ar ais a úsáidtear go coitianta le haghaidh miRNA modh lúb gas agus modh fuíll.
Is é an modh gas-lúb ná an miRNA a leathnú trí phriméirí gas-lúb a chur leis.Tá íogaireacht agus sainiúlacht níos airde ag an modh braite seo, ach tá an tréchur braite íseal.Ní féidir le tras-scríobh droim ar ais amháin ach miRNA amháin agus tagairt inmheánach a bhrath;Tá an modh cur leis eireaball comhdhéanta de dhá Déantar é a chomhlánú le comhghníomhaíocht dhá einsím, is iad sin PolyA polymerase agus transcriptase droim ar ais.Tá PolyA polymerase freagrach as eireabaill PolyA a chur le miRNA chun a fhad a mhéadú, agus déanann transcriptase droim ar ais imoibriú trascríobh droim ar ais.Tá tréchur braite ard ag an modh seo agus féadann sé miRNAanna iolracha agus tagairtí inmheánacha a bhrath in aon tras-scríobh droim ar ais amháin, ach tá an íogaireacht agus an tsainiúlacht íseal sa mhodh lúb gas.