Is é PCR an teicneolaíocht aimplithe aigéid núicléacha is forleithne a úsáidtear agus úsáidtear go forleathan é mar gheall ar a íogaireacht agus a shainiúlacht.Mar sin féin, éilíonn PCR dínádúrú teirmeach arís agus arís eile agus ní féidir fáil réidh leis na teorainneacha a bhaineann le brath ar ionstraimí agus trealamh, rud a chuireann srian lena chur i bhfeidhm i dtástáil chliniciúil allamuigh.

Ó na 1990idí go luath, tá go leor saotharlanna tar éis tosú ag forbairt teicneolaíocht aimplithe teochta seasta nach gá dínádúrú teirmeach.Anois tá teicneolaíocht aimplithe isiteirmeach lúb-idirghabhála forbartha acu, teicneolaíocht aimplithe isiteirmeach athsholáthair snáithe, teicneolaíocht aimplithe isiteirmeach ciorcal rollta, agus spleáchas seicheamh aigéad núicléach.Teicneolaíocht aimpliúcháin isothermal agus teicneolaíochtaí eile. 

Laimpliú isiteirmeach trí mheán oop

Tá prionsabal an aimplithe bunaithe ar an bhfíric go bhfuil DNA i stát cothromaíochta dinimiciúil ag timpeall 65°C.Nuair a dhéantar bunphéireáil ar aon primer agus nuair a leathnaítear é go dtí an chuid chomhlántach de DNA dúbailte-shnáithe, dícheangail an snáithe eile agus éireoidh sé aon-shnáithe.

Ag an teocht seo, úsáideann DNA 4 primer ar leith chun brath ar pholaiméiráis DNA díláithrithe snáithe chun sintéis DNA díláithrithe snáithe a dhéanamh féin-chiorclach go leanúnach.

Déan na 6 réigiún ar leith F3, F2, F1, B1, B2, B3 a chinneadh ar an spriocghéine ar dtús, agus ansin dearadh 4 primer bunaithe ar na 6 réigiún ar leith seo (mar a thaispeántar san fhigiúr thíos):

Tá an réamhphríomhaire istigh (FIP) comhdhéanta de F1c agus F2.

Tá an primer taobh istigh siar (BIP) comhdhéanta de B1c agus B2, agus úsáidtear TTTT mar spásálaí sa lár.

Tá na primers seachtracha F3 agus B3 comhdhéanta faoi seach de réigiúin F3 agus B3 ar an spriocghéine.

I gcóras imoibrithe LAMP, tá tiúchan an primer istigh arís agus arís eile níos mó ná an primer seachtrach.Comhcheanglaítear an primer istigh leis an snáithe teimpléad ar dtús chun snáithe comhlántach a shintéisiú chun snáithe dúbailte DNA a chruthú.Ina dhiaidh sin, cuirtear an primer seachtrach le chéile leis an snáithe teimpléad chun snáithe dúbailte DNA a fhoirmiú.Faoi ghníomhaíocht BstDNA polymerase, scaoiltear an snáithe comhlántach arna shintéisiú ag an primer istigh.Tar éis sraith imoibrithe, foirmíonn an snáithe comhlántach ar deireadh snáithe amháin DNA le struchtúr dumbbell.

Úsáidtear an struchtúr dumbbell snáithe singil DNA féin mar theimpléad chun struchtúr idirthréimhse gas-lúb DNA a fhoirmiú go leanúnach le foirceann oscailte.Treoraíonn na primers inmheánacha agus seachtracha an struchtúr idirthréimhseach gas-lúb DNA chun dul faoi dhíláithriú snáitheanna agus imoibrithe sínte go leanúnach, agus ar deireadh cruthaíonn siad struchtúir iolracha gas-lúb le faid éagsúla.meascán DNA.

Buntáistí agus míbhuntáistí a bhaineann le aimpliú isiteirmeach lúb-idirghabhála

Buntáistí LAMP:

(1) Ard-éifeachtúlacht aimpliúcháin, is féidir a mhéadú go héifeachtach 1-10 cóip den spriocghéine laistigh de 1h, agus tá an éifeachtacht aimplithe 10-100 uair níos mó ná an gnáth PCR.

(2) Tá an t-am imoibrithe gearr, tá an sainiúlacht láidir, agus níl aon trealamh speisialta ag teastáil.

Easnaimh LAMP:

(1) Tá na ceanglais maidir le primers go háirithe ard.

(2) Ní féidir an táirge aimplithe a úsáid le haghaidh clónáil agus seicheamhú, ach ní féidir é a úsáid ach amháin le haghaidh breithiúnais.

(3) Mar gheall ar a íogaireacht láidir, tá sé éasca aerasóil a fhoirmiú, rud a fhágann go bhfuil dearfach bréagach agus a dhéanann difear do thorthaí na tástála.

Saimpliú díláithrithe traidisiúnta

Teicníc aimplithe DNA isiteirmeach in vitro is ea aimpliú díláithrithe snáithe (SDA) atá bunaithe ar imoibriú einsímeach a mhol an scoláire Meiriceánach Walker ar dtús i 1992.

Áirítear leis an gcóras bunúsach SDA endonuclease srianta, polaiméaráis DNA le gníomhaíocht díláithrithe snáithe, dhá phéire primers, dNTPs, agus iain cailciam agus maignéisiam agus córais maoláin.

Tá prionsabal an aimplithe díláithrithe snáithe bunaithe ar an seicheamh aitheantais endonuclease srianta modhnaithe go ceimiceach ag an dá cheann den DNA sprice.Osclaíonn an endonuclease an bhearna sa snáithe DNA ag a shuíomh aitheantais, agus leathnaíonn an polaiméaráis DNA an bhearna 3′ Críochnaigh agus cuirtear an chéad snáithe DNA eile ina áit.

Is féidir na snáitheanna aonair DNA athsholáthair a chomhcheangal le primers agus iad a shíneadh ina snáitheanna dúbailte le DNA polymerase.Déantar an próiseas seo a athdhéanamh go leanúnach, ionas go ndéanfar an seicheamh sprice a aimpliú go héifeachtach.

Buntáistí agus míbhuntáistí na teicneolaíochta aimplithe díláithrithe snáithe

Buntáistí an SDA:

Tá an éifeachtacht aimpliúcháin ard, tá an t-am imoibrithe gearr, tá an sainiúlacht láidir, agus níl aon trealamh speisialta ag teastáil.

Easnaimh an SDA:

Níl na táirgí aonfhoirmeach, agus déantar roinnt táirgí aon-shnáithe agus dhá shnáithe a tháirgeadh i dtimthriall SDA i gcónaí, agus is cinnte go dtarlóidh fuíoll nuair a aimsítear leictreafóiréis.

Raimpliú ciorcal olling

Moltar aimpliú ciorcal rollta (RCA) trí úsáid a bhaint as an modh chun DNA ó orgánaigh phataigineacha a chóipeáil trí chiorcal rollta.Tagraíonn sé d'úsáid DNA ciorclach aon-shnáithe mar theimpléad ag teocht tairiseach, agus polaiméaráis DNA speisialta (mar shampla Phi29) ) Faoi ghníomhaíocht shintéis DNA ciorcal rollta chun aimpliú na sprice géine a bhaint amach.

Is féidir RCA a roinnt ina aimpliú líneach agus ina aimpliú easpónantúil.Is féidir le héifeachtacht RCA líneach 10 a bhaint amach⁵amanna, agus is féidir le héifeachtacht RCA easpónantúil 10 a bhaint amach⁹amanna.

Idirdhealú simplí, mar a thaispeántar san fhíor thíos, ní úsáideann aimpliú líneach a ach 1 primer, tá 2 primer ag aimpliú easpónantach b.

Tugtar RCA líneach ar primer aonair RCA freisin.Ceanglaíonn primer le DNA ciorclach agus déantar é a shíneadh le gníomh DNA polymerase.Is snáithe líneach aonair é an táirge le líon mór de sheichimh athchleachtach na mílte uair fad lúb amháin.

Ós rud é go bhfuil an táirge de RCA líneach ceangailte i gcónaí leis an primer tosaigh, is buntáiste mór é socrú éasca an chomhartha.

RCA easpónantúil, ar a dtugtar freisin mar aimpliú Hyper brainseach HRCA (Hyper brainseach RCA), i RCA easpónantúil, amplifies primer amháin an táirge RCA, hibridíonn an dara primer leis an táirge RCA agus leathnaíonn, agus tá an t-athsholáthar faoi cheangal cheana féin leis an táirge RCA Síneann primers anuas an tsnáithe, agus síneadh agus athsholáthar arís agus arís eile chun táirge dendritic RCA a tháirgeadh.

Na buntáistí agus na míbhuntáistí a bhaineann le aimpliú aigéad núicléach ciorcal rollta

Buntáistí RCA:

Íogaireacht ard, sainiúlacht maith agus oibriú éasca.

Easnaimh an RCA:

Fadhbanna cúlra le linn braite comhartha.Le linn an imoibrithe RCA, féadfaidh an taiscéalaí glas clap neamhchiorclaithe agus an teimpléad DNA nó RNA den taiscéalaí neamhcheangailte roinnt comharthaí cúlra a ghiniúint. 

Naimpliú seicheamh-úicléicicíde

Is teicneolaíocht nua é aimpliú seicheamh-bhunaithe aigéid núicléigh (NASBA) a forbraíodh ar bhonn PCR.Is aimpliú aigéad núicléach leanúnach agus isothermal é atá á threorú ag péire primers le seicheamh tionscnóra T7.Is féidir leis an teicneolaíocht an teimpléad RNA a mhéadú thart ar 109 uair i thart ar 2 uair an chloig, atá 1000 uair níos airde ná an modh PCR traidisiúnta agus nach bhfuil gá le trealamh speisialta.

Baineadh úsáid as an teicneolaíocht seo chun galair a dhiagnóisiú go tapa chomh luath agus a bhí an chuma air, agus úsáideann go leor cuideachtaí an modh seo i bhfeisteáin braite RNA faoi láthair.

Cé gur féidir le aimpliú RNA teicneolaíocht PCR trascríobh droim ar ais a úsáid freisin, tá a buntáistí féin ag NASBA: is féidir é a dhéanamh faoi choinníollacha teochta réasúnta seasmhach, agus tá sé níos cobhsaí agus níos cruinne ná an teicneolaíocht PCR traidisiúnta.

Is é an t-imoibriú ag 41 céim Celsius agus éilíonn AMV (víreas myeloblastosis éanúil) droim ar ais transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase agus péire de primers a chur i gcrích.

Áirítear leis an bpróiseas go príomha:

Tá seicheamh comhlántach an tionscnóra T7 sa réamhphríomhaire.Le linn an imoibrithe, ceanglaíonn an réamhphríomhaire leis an snáithe RNA agus déantar é a chatalú ag an einsím AMV chun snáithe dúbailte DNA-RNA a dhéanamh.

Díolann RNase H an RNA sa snáithe dúbailte hibrideach agus coinníonn sé an DNA aonshnáithe.

Faoi ghníomhaíocht an primer droim ar ais agus an einsím AMV, cruthaítear snáithe dúbailte DNA ina bhfuil an t-ord tionscnóra T7.

Faoi ghníomhaíocht T7 RNA polymerase, cuirtear an próiseas trascríobh i gcrích agus déantar cuid mhór de sprioc RNA a tháirgeadh.

Buntáistí NASBA:

(1) Tá seicheamh tionscnóra T7 ag a primer, ach níl aon seicheamh tionscnóra T7 ag an DNA eachtrach dúbailte-snáithe agus ní féidir é a mhéadú, agus mar sin tá sainiúlacht agus íogaireacht ard ag an teicneolaíocht seo.

(2) Ionchorpraíonn NASBA go díreach an próiseas trascríobh droim ar ais isteach san imoibriú aimpliúcháin, ag giorrú an t-am imoibrithe.

Míbhuntáistí NASBA:

(1) Tá na comhpháirteanna imoibrithe níos casta.

(2) Tá gá le trí chineál einsím chun an costas imoibrithe a dhéanamh níos airde.