Is é luach Ct an fhoirm léirithe torthaí is tábhachtaí de PCR cainníochtúla fluaraiseacha.Úsáidtear é chun difríochtaí slonn géine nó uimhir chóip géine a ríomh.Mar sin, cad é luach Ct an chainníochtúcháin fhluaraiseachta a mheastar a bheith réasúnta?Conas raon éifeachtach luach Ct a chinntiú?
Cad is Luach Ct ann?
Le linn an phróisis aimplithe qPCR, líon comhfhreagrach na dtimthriallta aimpliúcháin (Tairseach Rothaíochta) nuair a shroicheann comhartha fluaraiseachta an táirge aimplithe an tairseach fluaraiseachta socraithe.Seasann C do Cycle agus seasann T do Threshold.Níl ort ach a chur, is é luach Ct líon na dtimthriallta a fhreagraíonn do nuair a shroicheann an t-aimpliú teimpléad tosaigh méid áirithe táirge i qPCR.Míneofar “méid áirithe táirge” mar a thugtar air níos déanaí.
Cad a dhéanann an luach Ct?
1.Caidreamh idir aimpliú easpónantúil, méid an teimpléid agus luach Ct
Go hidéalach, carntar géinte i qPCR trí aimpliú easpónantúil tar éis líon áirithe timthriallta.Is é an gaol idir líon na dtimthriallta aimpliúcháin agus méid na dtáirgí ná: Méid an táirge aimplithe = méid an teimpléid tosaigh × (1+En) líon na dtimthriallta.Mar sin féin, ní bhíonn an t-imoibriú qPCR i staid idéalach i gcónaí.Nuair a shroicheann méid an táirge aimplithe “méid táirge áirithe”, is é an luach Ct líon na dtimthriallta ag an am seo, agus tá sé sa tréimhse aimplithe easpónantúil.An gaol idir an luach Ct agus méid an teimpléid tosaigh: Tá gaol líneach idir luach Ct an teimpléid agus logarithm uimhir chóip tosaigh an teimpléid.Dá airde an tiúchan teimpléad tosaigh, is lú an luach Ct;dá ísle an tiúchan teimpléad tosaigh, is mó an luach Ct.
Cuar 2.Amplification, tairseach fluaraiseachta agus méid áirithe táirge PCR
Cuirtear méid an táirge aimpliúcháin qPCR i láthair go díreach i bhfoirm comhartha fluaraiseacha, is é sin, an cuar aimpliúcháin.I gcéim luath PCR, tá an t-aimpliú faoi choinníollacha idéalach, tá líon na dtimthriallta beag, tá carnadh an táirge beag, agus ní féidir an leibhéal fluaraiseachta a idirdhealú go soiléir ón gcúlra fluaraiseachta.Tar éis sin, méadaíonn an fhluaraiseacht agus téann sé isteach sa chéim easpónantúil.Is féidir méid an táirge PCR a bhrath ag pointe áirithe nuair a bhíonn an imoibriú PCR díreach sa chéim easpónantúil, ar féidir é a úsáid mar “méid áirithe táirge”, agus is féidir ábhar tosaigh an teimpléid a bhaint as seo.Dá bhrí sin, is é an tairseach fluaraiseachta an déine comhartha fluaraiseachta a fhreagraíonn do mhéid áirithe táirge.
Sa chéim dheireanach de PCR, ní léiríonn an cuar aimpliúcháin aimpliú easpónantúil a thuilleadh, agus téann sé isteach sa chéim líneach agus sa chéim ardchlár.
3.Reproducibility de luachanna Ct
Nuair a shroicheann an timthriall PCR uimhir timthriall an luach Ct, tá sé díreach tar éis dul isteach sa tréimhse aimplithe easpónantúil fíor.Ag an am seo, níl an earráid bheag aimplithe, agus mar sin tá in-atáirgtheacht an luach Ct den scoth, is é sin, an teimpléad céanna a aimpliú ag amanna éagsúla nó i bhfeadáin éagsúla ag an am céanna.Aimpliú, tá an luach Ct faighte tairiseach.
Éifeachtúlacht 1.Amplification En
Tagraíonn éifeachtúlacht aimplithe PCR don éifeachtúlacht lena n-athraíonn an polaiméarás an ghéin chun aimplitiúid a aimpliú.Is é 100% an éifeachtacht aimplithe nuair a dhéantar móilín DNA amháin a chlaochlú ina dhá mhóilín DNA.Cuirtear éifeachtúlacht aimpliúcháin in iúl go coitianta mar En.D'fhonn anailís a dhéanamh ar na hailt ina dhiaidh sin a éascú, tugtar isteach go hachomair na fachtóirí a théann i bhfeidhm ar an éifeachtúlacht aimpliúcháin.
| Fachtóirí tionchar | míniú | Conas breithiúnas a thabhairt? |
| A. Coscairí PCR | 1. Tá substaintí sa teimpléad DNA a chuireann bac ar imoibriú PCR, amhail próitéiní nó glantaigh.2. Tá tiúchan ard de chomhpháirteanna imoibrí RNA nó RT teimpléid sa cDNA tar éis trascríobh droim ar ais, rud a d'fhéadfadh bac a chur ar imoibriú PCR ina dhiaidh sin. | 1. Is féidir a mheas an bhfuil truailliú ann tríd an gcóimheas A260/A280 agus A260/A230 nó leictreafóiréis RNA a thomhas.2. Cibé an bhfuil an cDNA caolaithe de réir cóimheas áirithe tar éis trascríobh droim ar ais. |
| B. Dearadh míchuí primer | Ní chuireann primers anneal go héifeachtach | Seiceáil primers le haghaidh primer-dimers nó bioráin ghruaige, neamhréireanna, agus uaireanta a chuimsíonn dearaí intronic. |
| C. Dearadh clár imoibrithe PCR míchuí | 1. Ní féidir le primers anáil go héifeachtach2. Scaoileadh neamhleor DNA polymerase 3. Laghdaigh gníomhaíocht DNA polymerase ard-teocht fadtéarmach | 1. Tá an teocht annealing níos airde ná luach TM an primer2. Tá an t-am réamh-dínádúraithe ró-ghearr 3. Tá am gach céim den nós imeachta imoibrithe ró-fhada |
| D. Meascadh imoibrithe nó earráidí píbéireachta neamhleor | Sa chóras imoibrithe, tá an tiúchan áitiúil de chomhpháirteanna imoibrithe PCR ró-ard nó míchothrom, rud a fhágann go bhfuil aimpliú PCR neamh-easpónantúil ann. | |
| E. Fad Amplicon | Tá fad an aimplicon ró-fhada, níos mó ná 300bp, agus tá an éifeachtacht aimpliúcháin íseal | Seiceáil go bhfuil an fad aimplicon idir 80-300bp |
| F. Tionchar imoibrithe qPCR | Tá tiúchan DNA polymerase san imoibrí íseal nó níl tiúchan na n-ian sa mhaolán optamaithe, rud a fhágann nach sroicheann gníomhaíocht einsím Taq an t-uasmhéid | Éifeachtúlacht aimpliúcháin a chinneadh de réir cuar caighdeánach |
2.Range de luachanna Ct
Tá raon luachanna Ct ó 15-35.Má tá an luach Ct níos lú ná 15, meastar go bhfuil an aimpliú laistigh de raon na tréimhse bunlíne agus nach bhfuil an tairseach fluaraiseachta bainte amach.Go hidéalach, tá gaol líneach idir luach Ct agus logarithm uimhir chóip tosaigh an teimpléid, is é sin, an cuar caighdeánach.Tríd an gcuar caighdeánach, nuair a bhíonn an éifeachtacht aimpliúcháin 100%, tá an luach Ct ríofa chun uimhir chóip aonair na géine a chainníochtú thart ar 35. Má tá sé níos mó ná 35, tá uimhir chóip tosaigh an teimpléid go teoiriciúil níos lú ná 1, is féidir a mheas gan bhrí.
I gcás raonta éagsúla géine Ct, mar gheall ar an difríocht i líon cóip géine agus éifeachtúlacht aimplithe sa mhéid teimpléad tosaigh, is gá cuar caighdeánach a dhéanamh don ghéine agus raon braite líneach na géine a ríomh.
3.Fachtóirí tionchair de luach Ct
Ón gcaidreamh idir líon na dtimthriallta aimpliúcháin agus méid an táirge: méid an táirge aimplithe = méid an teimpléid tosaigh × (1+En) líon timthriall, is féidir a fheiceáil, faoi choinníollacha idéalach, go mbeidh tionchar diúltach ag méid an teimpléid tosaigh agus En ar luach Ct.Cuirfidh an difríocht i gcáilíocht teimpléad nó éifeachtúlacht aimplithe faoi deara go mbeidh an luach Ct ró-mhór nó ró-bheag.
Tá luach 4.Ct ró-mhór nó ró-bheag
Am poist: Feabhra-22-2023
