I dturgnaimh qPCR, is nasc an-tábhachtach é dearadh primer freisin.Cibé an bhfuil na primers oiriúnach nó nach bhfuil a bhaineann go dlúth le cibé an sroicheann an éifeachtacht aimplithe an caighdeán, cibé an bhfuil na táirgí aimplithe sainiúil, agus cibé an bhfuil na torthaí turgnamhacha ar fáil.
Mar sin, conas sainiúlacht primer qPCR a dhéanamh níos fearr?Éifeachtúlacht aimpliúcháin ard?
Sa lá atá inniu ann, tabharfaimid duit primers qPCR a dhearadh le chéile, agus ligfimid do dhearadh primer qPCR a bheith ina scil éifeachtach i dturgnaimh.
Agus primers qPCR á dhearadh, tabhair aird ar na pointí seo a leanas de ghnáth: ba chóir primers a dhearadh thar introns oiread agus is féidir, ba cheart go mbeadh fad an táirge 100-300 bp, ba cheart go mbeadh an luach Tm chomh gar agus is féidir do 60 ° C, agus ba chóir go mbeadh na primers in aghaidh an tsrutha agus anuas chomh gar agus is féidir, agus ba chóir go mbeadh deireadh an primer G nó C, etc.
1. Dearadh na primers a chuimsíonn introns
Agus primers qPCR á ndearadh, féadann roghnú primers deartha trasna introns an teimpléad gDNA a aimpliú a chosc, agus díorthaítear na táirgí go léir ó aimpliú cDNA, rud a chuireann deireadh le tionchar éillithe gDNA.
2. Fad primer
Is é an fad primer go ginearálta idir 18-30 nt, agus ba cheart fad an táirge aimpliúcháin a rialú idir 100-300 bp oiread agus is féidir.
Má tá an primer ró-ghearr, beidh aimpliú neamh-shonrach mar thoradh air, agus má tá sé ró-fhada, foirmeoidh sé struchtúr tánaisteach go héasca (cosúil le struchtúr hairpin).Má tá an táirge aimpliúcháin ró-fhada, níl sé oiriúnach le haghaidh imoibriú polymerase, rud a dhéanfaidh difear d'éifeachtúlacht aimplithe PCR.
3. Ábhar GC agus luach Tm
Ba cheart ábhar GC na primers a rialú idir 40% agus 60%.Má tá sé ró-ard nó ró-íseal, ní chabhródh sé leis an imoibriú a thionscnamh.Ba cheart go mbeadh ábhar GC na primers tosaigh agus droim ar ais gar don chéanna chun an luach Tm céanna agus an teocht annealaithe a fháil.
Ba cheart go mbeadh an luach Tm idir 55-65°C chomh fada agus is féidir, go ginearálta thart ar 60°C, agus ba cheart go mbeadh luach Tm in aghaidh an tsrutha agus le sruth chomh gar agus is féidir, agus b’fhearr gan a bheith níos mó ná 4°C.
4. Seachain A a roghnú ag deireadh 3′ an primer
Nuair a bhíonn deireadh 3′ an primer mímheaitseála, tá difríochtaí móra ann maidir le héifeachtúlacht sintéise bunanna éagsúla.Nuair a bhíonn an bonn deireanach A, féadann sé sintéis slabhra a thionscnamh fiú amháin i gcás mímheaitseála, agus nuair a bhíonn an bonn deireanach T Nuair a bhíonn , laghdaítear éifeachtacht an ionduchtaithe mímheaitseála go mór.Mar sin, déan iarracht A a sheachaint ag deireadh 3′ an primer, agus is fearr T a roghnú.
Más primer taiscéalaithe é, ní féidir le deireadh 5′ an taiscéalaithe a bheith G, mar fiú nuair a bhíonn bonn amháin G ceangailte leis an ngrúpa tuairisceoirí fluaraiseacha FAM, is féidir le G an comhartha fluaraiseachta a astaíonn an grúpa FAM a mhúchadh freisin, rud a fhágann torthaí diúltacha bréagacha.Nocht.
5. Dáileadh bonn
B’fhearr go bhfuil dáileadh na gceithre bhonn sa phriméir randamach, ag seachaint níos mó ná 3 G nó C as a chéile ag an deireadh 3′, agus níos mó ná 3 i ndiaidh a chéileTá G nó C éasca le péireáil a ghiniúint sa réigiún seicheamh saibhir GC.
6. Ba cheart go seachnódh an réigiún dearadh primer struchtúir chasta tánaisteacha.
Cuirfidh an struchtúr tánaisteach atá déanta ag an snáithe aonair den táirge aimpliúcháin isteach ar dhul chun cinn rianúil PCR.Trí thuar an bhfuil struchtúr tánaisteach sa seicheamh sprioc roimh ré, déan iarracht an réigiún seo a sheachaint i ndearadh primers.
7. Ba chóir go ndéanfadh na primers féin agus idir na primers iarracht bunanna comhlántacha i ndiaidh a chéile a sheachaint.
Ní féidir aon chomhlántacht 4 bhonn as a chéile a bheith ann idir an primer féin agus an primer.Níor cheart go mbeadh seicheamh comhlántach ag an primer féin, ar shlí eile déanfaidh sé é féin a fhilleadh chun struchtúr hairpin a fhoirmiú, a dhéanfaidh difear do chomhcheangal annealing an primer agus an teimpléad.
Ní féidir le seichimh chomhlántacha a bheith ann idir primers in aghaidh an tsrutha agus iartheachtacha.Déanfaidh comhlántacht idir primers dimers primer a tháirgeadh, rud a laghdóidh éifeachtacht PCR agus fiú tionchar a imirt ar chruinneas cainníochtúil.Mura féidir na struchtúir primer-dimer agus hairpin a sheachaint, níor cheart go mbeadh an luach △G ró-ard (ba chóir go mbeadh sé níos lú ná 4.5 kcal/mol).
8. Aimplíonn na primers an sprioctháirge sonrach.
Is é an sprioc deiridh a bhaineann le braite qPCR ná raidhse na sprice géine a thuiscint.Má tharlaíonn aimpliú neamhshonrach, beidh an cainníochtú míchruinn.Dá bhrí sin, tar éis na primers a dhearadh, ní mór iad a thástáil le BLAST, agus déantar comparáid idir sainiúlacht na dtáirgí sa bhunachar sonraí seicheamh.
Ansin, glacaimid an ghéine daonna GAS6 (Gabháil fáis 6 ar leith) mar shampla chun primers qPCR a dhearadh.
01 géine cheist
Homo GAS6trí NCBI.Anseo, ba cheart dúinn aird a thabhairt ar an ainm géine agus an speiceas a chur i gcomparáid lena chinntiú go bhfuil siad comhsheasmhach.
02 Faigh an seicheamh géine
(1) Más DNA géanóm é an sprioc-sheicheamh, roghnaigh an chéad cheann, arb é seicheamh géanóm DNA na géine é.
(2) Más mRNA an sprioc-sheicheamh, roghnaigh an dara ceann.Tar éis duit dul isteach, cliceáil "CDS" sa tábla thíos.Is é an t-ord cúlra donn seicheamh códaithe na géine.
03 Dearadh primers
Cuir isteach an comhéadan Primer-BLAST
Cuir isteach an uimhir seicheamh géine nó an t-ord i bhformáid Fasta ar chlé uachtarach, agus líon isteach na paraiméadair ábhartha.

Cliceáil “Faigh primers” agus beidh an NCBI aníos chun a insint duit go ndéanfar an roghnú paraiméadar sin a mhéadú go dtí leaganacha splicing eile.Is féidir linn na leaganacha éagsúla splicing a sheiceáil agus iad a chur isteach chun an péire primer cuí a fháil (mar a thaispeántar san fhigiúr thíos).Seans go dtógfaidh an próiseas seo na mílte soicind le rith.
Tá teocht anáil na bpéirí priméir seo ar fad timpeall 60°C.De réir chuspóir an turgnaimh, roghnaigh primers le fad measartha, sainiúlacht mhaith agus níos lú féin-chomhlánú na primers don turgnamh, agus tá an ráta ratha ard go leor!
04 Fíorú sainiúlachta primer
Go deimhin, chomh maith le primers a dhearadh, is féidir le Primer-Blast meastóireacht a dhéanamh freisin ar na primers a dhearamar dúinn féin.Fill ar an leathanach dearadh primer, cuir isteach na primers in aghaidh an tsrutha agus anuas atá deartha againn, agus ní dhéanfar paraiméadair eile a choigeartú.Tar éis duit a chur isteach, is féidir leat a fheiceáil an bhfuil an péire primers ann freisin ar ghéinte eile.Má tá gach ceann acu ar taispeáint ar an géine ba mhaith linn a amplify , rud a léiríonn go bhfuil sainiúlacht an péire primers iontach!(Mar shampla, is é seo an t-aon toradh ar an gceist primer!)

05 Breithiúnas cáilíochta den chéad scoth
Cén cineál primer é an primer “foirfe” a chomhcheanglaíonn “éifeachtúlacht aimplithe suas go caighdeán”, “saintréithe táirge aimplithe”, agus “torthaí turgnamhacha iontaofa”?
Éifeachtúlacht aimpliúcháin

cuar leá
Sroicheann éifeachtacht aimpliúcháin na primers 90% -110%, rud a chiallaíonn go bhfuil an éifeachtacht aimplithe go maith, agus tá buaic amháin ag an gcuar leá agus de ghnáth Tm> 80 ° C, rud a chiallaíonn go bhfuil an tsainiúlacht aimpliúcháin maith.
 
Táirgí Gaolmhara:
Fíor-Ama PCR Éasca – SYBR GREEN I
Fíor-ama PCR Easy-Taqman