• Is modh é PCR a úsáidtear chun DNA a mhéadú ó líon beag teimpléad DNA.Úsáideann RT-PCR trascríobh droim ar ais chun teimpléad DNA a tháirgeadh ó fhoinse RNA ar féidir a mhéadú ansin.
• Is imoibrithe críochphointe iad PCR agus RT-PCR de ghnáth, agus úsáideann qPCR agus RT-qPCR cinéitic an ráta sintéise táirge le linn imoibriú PCR chun méid an teimpléid atá i láthair a chainníochtú.
• Soláthraíonn modhanna níos nuaí, mar PCR digiteach, cainníochtú iomlán ar an teimpléad DNA tosaigh, agus laghdaíonn modhanna mar PCR isothermal an gá atá le trealamh costasach chun torthaí iontaofa a sholáthar.

Is teicníc bitheolaíocht mhóilíneach sách simplí é imoibriú slabhra pholaiméiráis (PCR) chun seichimh DNA agus RNA a aimpliú agus a bhrath.I gcomparáid le modhanna traidisiúnta de chlónáil DNA agus aimpliú, is féidir a ghlacadh go minic laethanta, éilíonn PCR ach cúpla uair an chloig.Tá PCR an-íogair agus éilíonn sé teimpléad íosta chun seichimh shonracha a bhrath agus a aimpliú.Tá modhanna bunúsacha PCR chun cinn níos mó ó bhrath simplí DNA agus RNA.Anseo thíos, tá forbhreathnú tugtha againn ar na modhanna éagsúla PCR agus na himoibrithe a chuirimid ar fáil ag Enzo Life Sciences do do riachtanais taighde.Tá sé mar aidhm againn cabhrú le heolaithe teacht go tapa ar imoibrithe PCR le húsáid ina gcéad tionscadal taighde eile!

PCR

Le haghaidh PCR caighdeánach, níl uait ach polaiméaráis DNA, maignéisiam, núicléatídí, primers, an teimpléad DNA atá le aimpliú, agus teirm-cineál.Tá an mheicníocht PCR chomh simplí lena chuspóir: 1) déantar DNA dúbailte-shnáithe (dsDNA) a dhínádúrú le teas, 2) ailíníonn na primers leis na snáitheanna aonair DNA, agus 3) leathnaítear na primers le DNA polymerase, agus mar thoradh air sin tá dhá chóip den snáithe DNA bunaidh.Tugtar timthriall aimpliúcháin amháin ar an bpróiseas dínádúraithe, annealaithe agus fadaithe thar shraith teochtaí agus uaireanta (Fíor 1).

Ba cheart gach céim den timthriall a bharrfheabhsú don teimpléad agus don tacar primer a úsáidtear.Déantar an timthriall seo a athdhéanamh thart ar 20-40 uair, agus is féidir an táirge aimplithe a anailísiú ansin, de ghnáth trí fhoirmiú agarose (Fíor 2).

Toisc gur modh an-íogair é PCR agus go bhfuil méideanna an-bheag ag teastáil le haghaidh imoibrithe aonair, moltar máistir-mheascán a ullmhú le haghaidh roinnt imoibrithe.Ní mór an máistir-mheascán a mheascadh go maith agus ansin a roinnt faoi líon na n-imoibrithe, ag cinntiú go mbeidh an méid céanna einsíme, dNTPanna agus primers i ngach imoibriú.Tairgeann go leor soláthróirí, mar shampla Enzo Life Sciences, meascáin PCR a bhfuil gach rud iontu cheana féin seachas primers agus an teimpléad DNA.

Is dúshlán iad réigiúin atá saibhir i Guanín/Cítoisín (GC-saibhir) i dteicnící caighdeánacha PCR.Tá seichimh atá saibhir i GC níos cobhsaí ná seichimh le hábhar GC níos ísle.Ina theannta sin, is gnách go gcruthaíonn seichimh ar mhórán GC struchtúir thánaisteacha, mar lúba bioráin ghruaige.Mar thoradh air sin, tá sé deacair snáitheanna dúbailte saibhir GC a scaradh go hiomlán le linn na céime dínádúraithe.Mar thoradh air sin, ní féidir le DNA polaiméireáis an snáithe nua a shintéisiú gan bhac.Is féidir le teocht dínádúraithe níos airde é seo a fheabhsú, agus is féidir le coigeartuithe i dtreo teocht anáil níos airde agus am annealaithe níos giorra cosc ​​a chur ar cheangal neamhshonrach primers saibhir GC.Is féidir le himoibrithe breise feabhas a chur ar aimpliú seichimh atá saibhir i GC.Cuidíonn DMSO, gliocról, agus betaine le cur isteach ar na struchtúir tánaisteacha is cúis le hidirghníomhaíochtaí GC agus ar an gcaoi sin éascaíonn siad scaradh na snáitheanna dúbailte.

PCR Tosaigh te

Is fadhb é aimpliú neamhshonrach a d’fhéadfadh tarlú le linn PCR.Is fearr a oibríonn polaiméirí DNA a úsáidtear le haghaidh PCR ag teochtaí timpeall 68°C go 72°C.Is féidir leis an einsím a bheith gníomhach, áfach, ag teochtaí níos ísle, cé go pointe níos ísle.Ag teocht i bhfad faoi bhun na teochta annealing, is féidir le primers ceangal neamh-sonrach agus a bheith ina chúis le aimpliú neamh-shonrach, fiú má tá an t-imoibriú ar bun ar oighear.Is féidir é seo a chosc trí úsáid a bhaint as coscairí polaiméireáis a dhíscaoileann ón DNA polaiméaráis ach amháin nuair a shroichtear teocht áirithe, agus mar sin an téarma tús te PCR.Is féidir leis an inhibitor a bheith ina antashubstaint a nascann an polaiméiráis agus dínádúraíonn ag an teocht dínádúraithe tosaigh (95 ° C go hiondúil).

Ard-Fidelity Polymerase

Cé go méadaíonn polaiméirí DNA go cothrom cruinn ar an seicheamh teimpléid bhunaidh, is féidir go dtarlódh botúin sa mheaitseáil núicléitíde.Is féidir tras-scríbhinní teasctha, agus próitéiní mí-aistrithe nó neamhghníomhacha le sruth a bheith mar thoradh ar mhímheaitseáil in fheidhmchláir mar chlónáil.Chun na neamhréireanna seo a sheachaint, sainaithníodh polaiméirí a bhfuil gníomhaíocht “léamh profaí” acu agus ionchorpraíodh iad sa sreabhadh oibre.Aithníodh an chéad pholaiméiráis profléamh, Pfu, i 1991 i Pyrococcus furiosus.Tá gníomhaíocht exonuclease 3' go 5' ag an einsím Pfu seo.De réir mar a aimplítear an DNA, baineann an t-eisea-núicléas núicléatídí mímheaitseála amach ag foirceann 3' an tsnáithe.Athsholáthraítear an núicléitíd cheart ansin, agus leanann sintéis DNA.Tá sainaithint seichimh mícheart núicléitíde bunaithe ar an gcleamhnas ceangailteach don triphosphate ceart nucleoside leis an einsím, nuair a mhoillíonn ceangailteach neamhéifeachtach an tsintéis agus go gceadaítear athsholáthar ceart.Mar thoradh ar ghníomhaíocht profléitheoireachta Pfu polymerase tá níos lú earráidí sa seicheamh deiridh i gcomparáid le Taq DNA polymerase.Le blianta beaga anuas, aithníodh einsímí profaí eile, agus rinneadh modhnuithe ar an einsím bunaidh Pfu chun an ráta earráide a laghdú tuilleadh le linn aimpliú DNA.

RT-PCR

Ceadaíonn trascríobh droim ar ais PCR, nó RT-PCR, úsáid RNA mar theimpléad.Ceadaíonn céim bhreise RNA a bhrath agus a aimpliú.Déantar an RNA droim ar ais a thrascríobh go DNA comhlántach (cDNA), ag baint úsáide as transcriptase droim ar ais.Tá cáilíocht agus íonacht an teimpléid RNA riachtanach do rathúlacht RT-PCR.Is é an chéad chéim de RT-PCR hibrideach DNA/RNA a shintéisiú.Tá feidhm RNase H ag an transcriptase droim ar ais freisin, a dhíghrádaíonn an chuid RNA den hibrideach.Críochnaítear an móilín DNA aon-shnáithe ansin ag an ngníomhaíocht DNA-chleithiúnach DNA polaiméaráis den transcriptase droim ar ais isteach i cDNA.Is féidir le héifeachtacht an imoibrithe chéad-shnáithe tionchar a imirt ar an bpróiseas aimplithe.As seo amach, úsáidtear an gnáthnós imeachta PCR chun an cDNA a mhéadú.Tá go leor buntáistí ag baint leis an bhféidearthacht RNA a chur ar ais ina cDNA ag RT-PCR, agus úsáidtear é go príomha le haghaidh anailíse géine.Tá RNA aonshnáithe agus an-éagobhsaí, rud a fhágann go bhfuil sé dúshlánach oibriú leis.Feidhmíonn sé go coitianta mar chéad chéim i qPCR, a dhéanann cainníochtú ar athscríbhinní RNA i sampla bitheolaíoch.

qPCR agus RT-qPCR

Úsáidtear PCR cainníochtúil (qPCR) chun aigéid núicléacha a bhrath, a thréithriú agus a chainníochtú le haghaidh feidhmeanna iomadúla.I RT-qPCR, is minic a dhéantar athscríbhinní RNA a chainníochtú trí iad a thras-scríobh ar ais i cDNA ar dtús, mar a thuairiscítear thuas, agus ansin déantar qPCR ina dhiaidh sin.Mar a dhéantar i PCR caighdeánach, déantar DNA a aimpliú trí thrí chéim athfhillteacha: dínádúrú, anáil agus fadú.Mar sin féin, i qPCR, cuireann lipéadú fluaraiseacha ar chumas sonraí a bhailiú de réir mar a théann PCR chun cinn.Tá go leor buntáistí ag baint leis an teicníc seo mar gheall ar an raon modhanna agus ceimicí atá ar fáil.

I qPCR dath-bhunaithe (glas go hiondúil), ceadaíonn lipéadú fluaraiseacha na móilíní DNA méadaithe a chainníochtú trí úsáid a bhaint as dath ceangailteach dsDNA.Le linn gach timthrialla, déantar an fhluaraiseacht a thomhas.Méadaíonn an comhartha fluaraiseachta go comhréireach leis an méid DNA a mhacasamhlú.Mar sin, déantar an DNA a chainníochtú i “fíor-am” (Fíor 3).Is iad na míbhuntáistí a bhaineann le qPCR dathbhunaithe ná nach féidir ach sprioc amháin a scrúdú ag an am agus go gceanglóidh an dath le haon ds-DNA atá sa sampla.

I qPCR taiscéalaithe-bhunaithe, is féidir go leor spriocanna a bhrath go comhuaineach i ngach sampla, ach éilíonn sé seo barrfheabhsú agus dearadh taiscéalaí(í) sprioc-shonracha a úsáidtear i dteannta le primers.Tá go leor cineálacha dearaí taiscéalaithe ar fáil, ach is é an cineál is coitianta ná taiscéalaí hidrealú, a chuimsíonn fluairféar agus múchadh.Cuireann aistriú fuinnimh athshondais fhluaraiseachta (FRET) cosc ​​ar astaíocht an fhluarafór tríd an múchadh agus an taiscéalaí slán.Mar sin féin, le linn an imoibrithe PCR, déantar an taiscéalaí a hidrealú le linn síneadh primer agus aimpliú na seicheamh sonrach a bhfuil sé faoi cheangal.Scarann ​​scoilteacht an taiscéalaí an fluarafór ón múchadh agus mar thoradh air sin bíonn méadú ar fhluaraiseacht atá ag brath ar aimpliú (Fíor 4).Mar sin, tá an comhartha fluaraiseachta ó imoibriú qPCR bunaithe ar thaiscéalaí comhréireach le méid an tseichimh sprice taiscéalaithe atá sa sampla.Toisc go bhfuil qPCR probe-bhunaithe níos sainiúla ná qPCR dath-bhunaithe, is minic a úsáidtear é i dtástálacha diagnóiseacha bunaithe ar qPCR.

Aimpliú Isothermal

Éilíonn na teicníochtaí PCR a luaitear thuas trealamh costasach teirmeachúpla chun teocht an tseomra a ardú agus a ísliú go cruinn le haghaidh na gcéimeanna dínádúraithe, annealaithe agus sínte.Forbraíodh roinnt teicníochtaí nach bhfuil gá le feistí cruinne den sórt sin agus is féidir iad a dhéanamh i ndabhach uisce simplí nó fiú laistigh de na cealla spéise.Tugtar aimpliú isiteirmeach ar na teicníochtaí seo le chéile agus obair atá bunaithe ar aimpliú easpónantúil, líneach nó cascáideach.

Is é an cineál aimplithe isiteirmeach is fearr aithne ná aimpliú isiteirmeach lúb-idirghabhála, nó LAMP.Úsáideann LAMP aimpliú easpónantúil ag 65⁰C chun teimpléad DNA nó RNA a aimpliú.Nuair a bhíonn LAMP á dhéanamh, úsáidtear ceithre nó sé primer atá comhlántach le réigiúin den sprioc-DNA le polaiméaráis DNA chun DNA nua a shintéisiú.Tá seichimh chomhlántacha ag dhá cheann de na primers seo a aithníonn seichimh sna primers eile agus a cheanglaíonn iad, rud a ligeann do struchtúr “lúb” a fhoirmiú sa DNA nua-shintéisithe a chuidíonn le annealú primer i mbabhtaí aimpliúcháin ina dhiaidh sin.Is féidir LAMP a léirshamhlú trí mhodhanna éagsúla, lena n-áirítear fluaraiseacht, leictreafóiréis glóthach agarose, nó dathmhéadracht.Toisc éascaíocht láithreacht nó easpa táirge de réir dathmhéadrachta a léirshamhlú agus a bhrath agus an easpa trealaimh costasach a bhí de dhíth, bhí LAMP ina rogha oiriúnach le haghaidh tástála SARS-CoV-2 i réimsí nach raibh fáil go héasca ar thástáil chliniciúil saotharlainne, nó samplaí a stóráil agus a iompar. nach raibh sé indéanta, nó i saotharlanna nach raibh trealamh teirmeachús PCR acu roimhe seo.