• Facebook
  • nascthain
  • youtube

Ábhar tosaigh: RNA

Trascríobh droim ar ais cainníochtúil Is modh turgnamhach é PCR (RT-qPCR) a úsáidtear i dturgnaimh PCR ag baint úsáide as RNA mar ábhar tosaigh.Ar an modh seo, déantar RNA iomlán nó RNA teachtaire (mRNA) a thrascríobh ar dtús go DNA comhlántach (cDNA) trí transcriptase droim ar ais.Ina dhiaidh sin, rinneadh imoibriú qPCR ag baint úsáide as an cDNA mar theimpléad.Baineadh úsáid as RT-qPCR in éagsúlacht feidhmeanna bitheolaíochta móilíneacha, lena n-áirítear anailís léiriú géine, bailíochtú trasnaíochta RNA, bailíochtú microarray, braite pataigin, tástáil ghéiniteach, agus taighde galair.

Modhanna aon-chéim agus dhá chéim le haghaidh RT-qPCR

Is féidir RT-qPCR a bhaint amach trí mhodh aon-chéim nó dhá chéim.Comhcheanglaíonn RT-qPCR aon-chéim tras-scríobh droim ar ais agus aimpliú PCR, rud a ligeann do transcriptase droim ar ais agus DNA polymerase an t-imoibriú a chomhlánú sa fheadán céanna faoi na coinníollacha maolánacha céanna.Ní éilíonn RT-qPCR aon-chéim ach úsáid a bhaint as primers seicheamh-shonracha.I RT-qPCR dhá chéim, déantar tras-scríobh droim ar ais agus aimpliú PCR i dhá fheadán, ag baint úsáide as maoláin optamaithe éagsúla, coinníollacha imoibrithe, agus straitéisí dearadh primer.

alt1

 

Buntáiste

Míbhuntáiste

Céim a hAon Tá níos lú earráide turgnamhacha ag an modh seo mar go ndéantar an dá imoibriú in aon fheadán amháin

 

Laghdaíonn níos lú céimeanna píopaithe an baol éillithe

 

Oiriúnach do aimpliú/scagadh ard-thréchuir, tapa agus in-atáirgthe

Ní féidir imoibrithe dhá chéim a bharrfheabhsú ar leithligh

 

Ós rud é go gcuirtear na coinníollacha imoibrithe i gcontúirt tríd an imoibriú dhá chéim a chomhcheangal, níl an íogaireacht chomh maith le híogaireacht an mhodha dhá chéim

 

Is beag an líon spriocanna a bhraitear le sampla amháin

Dhá Chéim Cumas leabharlanna cDNA cobhsaí a chruthú ar féidir iad a stóráil ar feadh tréimhsí fada ama agus a úsáid i bhfrithghníomhartha iolracha

 

Is féidir spriocghéinte agus géinte tagartha a mhéadú ón leabharlann cDNA chéanna gan gá le leabharlanna iolracha cDNA

 

Maoláin imoibrithe agus coinníollacha imoibrithe a chumasaíonn leas iomlán a bhaint as ritheann imoibrithe aonair

 

Roghnú solúbtha coinníollacha truicear

Trí fheadáin iolracha a úsáid, agus tuilleadh céimeanna píbéireachta méadaítear an baol éillithe DNA,

agus Tógann am.

 

Éilíonn leas iomlán a bhaint níos mó ná an modh aon-chéim

Táirgí gaolmhara:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Céim a hAon) -SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Céim a hAon) - Taqman

RT Easyᵀᴹ I Máistir Premix Do Shintéis CDNA Céad Snáithe

Fíor-ama PCR Easy-SYBR Green I Kit

Fíor-ama PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Roghnú iomlán RNA agus mRNA

Agus turgnamh RT-qPCR á dhearadh, tá sé tábhachtach cinneadh a dhéanamh ar cheart RNA iomlán nó mRNA íonaithe a úsáid mar theimpléad le haghaidh trascríobh droim ar ais.Cé go bhféadfadh mRNA íogaireacht beagán níos airde a sholáthar, is minic a úsáidtear RNA iomlán fós.Is é an chúis atá leis seo ná go bhfuil buntáiste níos tábhachtaí ag RNA iomlán mar ábhar tosaigh ná mRNA.Ar dtús, éilíonn an próiseas níos lú céimeanna íonúcháin, rud a chinntíonn aisghabháil cainníochtúil níos fearr ar theimpléad agus normalú níos fearr ar thorthaí go dtí líon na gceall tosaigh.Ar an dara dul síos, seachnaíonn sé an chéim saibhrithe mRNA, rud a d’fhéadfadh torthaí sceabhacha a sheachaint mar gheall ar ghnóthachain éagsúla mRNAanna éagsúla.Ar an iomlán, ós rud é go bhfuil cainníochtú coibhneasta na sprice géine níos tábhachtaí i bhformhór na n-iarratas ná íogaireacht iomlán an bhrath, tá RNA iomlán níos oiriúnaí i bhformhór na gcásanna.

primer trascríobh droim ar ais

Sa mhodh dhá chéim, is féidir trí mhodhanna éagsúla a úsáid chun an t-imoibriú cDNA a phríomhú: primers oligo(dT), primers randamach, nó primers seicheamh-shonracha.Go tipiciúil, úsáidtear primers oligo(dT) agus primers randamach i dteannta a chéile.Cuireann na primers seo in aghaidh an tsnáithe teimpléid mRNA agus cuireann siad tras-traipiseas droim ar ais le pointe tosaigh don tsintéis.

alt2

Roghnú primer Struchtúr agus feidhm Buntáiste Míbhuntáiste
primer Oligo(dT) (nó primer oligo(dT) ar ancaire) Annealing sínte chuig iarmhair tímín ag eireaball polai(A) mRNA;tá G, C, nó A ag an deireadh 3′ (láithreán ancaire) le primer ancaire oligo(dT) Sintéis de cDNA lánfhad ó mRNA pola(A) eireaball

 

Infheidhme nuair a bhíonn níos lú ábhar tosaigh ar fáil

 

Cinntíonn suíomh ancaireachta go gceanglaíonn an primer oligo(dT) d'eireaball 5′ polai(A) an mRNA

Níl sé oiriúnach ach amháin chun géinte a aimpliú le heireabaill phola(A).

 

Faigh cDNA teasctha ón suíomh priming*2 i bpola(A)

 

Claonadh chun ceangal go dtí an deireadh 3′*

 

* Laghdaítear an fhéidearthacht seo má úsáidtear priméirí oligo(dT) ar ancaire

primer randamach

 

6 go 9 bonn ar fad, ar féidir leo a anáil chuig láithreáin iolracha le linn trascríobh RNA Anneal do gach RNA (tRNA, rRNA, agus mRNA)

 

Oiriúnach do thras-scríbhinní le struchtúr tánaisteach suntasach, nó nuair atá níos lú ábhar tosaigh ar fáil

 

Toradh cDNA ard

Déantar cDNA droim ar ais a thrascríobh ó gach RNA, rud nach mbíonn ag teastáil de ghnáth agus d'fhéadfadh sé comhartha an sprice mRNA a chaolú

 

cDNA teasctha a fháil

primers seicheamh-shonracha Bunúsanna saincheaptha a dhíríonn ar sheichimh shonracha mRNA leabharlann cDNA ar leith

 

Feabhas a chur ar íogaireacht

 

Ag baint úsáide as primers qPCR droim ar ais

Níl sé teoranta ach amháin do shintéis sprice amháin

Trascríobh droim ar ais

Is einsím é transcriptase droim ar ais a úsáideann RNA chun DNA a shintéisiú.Tá gníomhaíocht RNase ag roinnt transcriptases droim ar ais agus is féidir leo snáitheanna RNA a dhíghrádú i snáitheanna hibrideacha RNA-DNA tar éis trascríobh.Mura bhfuil gníomhaíocht einsímeach RNase aige, is féidir RNaseH a chur leis le haghaidh éifeachtacht qPCR níos airde.I measc na n-einsímí a úsáidtear go coitianta tá víreas leoicéime Moloney murine droim ar ais transcriptase agus myeloblastoma éanúil víreas droim ar ais transcriptase.Le haghaidh RT-qPCR, tá sé oiriúnach transcriptase droim ar ais a roghnú le teirmeastatacht níos airde, ionas gur féidir sintéis cDNA a dhéanamh ag teochtaí níos airde, ag cinntiú go n-áiritheofar trascríobh rathúil RNAanna le struchtúr tánaisteach níos airde, agus a ngníomhaíocht iomlán á gcoimeád ar fud an imoibrithe, rud a fhágann go bhfuil táirgeacht cDNA níos airde.

Táirgí gaolmhara:

Trascríobh Droim ar Ais Foreasy M-MLV

Gníomhaíocht RNase H de thrascríobh droim ar ais

Tá RNaseH in ann snáitheanna RNA a dhíghrádú ó dhúpléacsanna RNA-DNA, rud a ligeann do shintéis éifeachtach DNA dhá shnáithe.Mar sin féin, agus mRNA fada á úsáid mar theimpléad, féadfar an RNA a dhíghrádú roimh am, agus cDNA teasctha mar thoradh air.Dá bhrí sin, is minic a bhíonn sé tairbheach gníomhaíocht RNaseH a íoslaghdú le linn clónáil cDNA má theastaíonn sintéis tras-scríbhinní fada.I gcodarsnacht leis sin, is minic a bhíonn tras-scríbhinní droim ar ais le gníomhaíocht RNase H tairbheach d'iarratais qPCR toisc go bhfeabhsaíonn siad leá déphléacsanna RNA-DNA le linn an chéad timthriall de PCR.

Dearadh primer

Ba cheart go hidéalach go ndéanfaí na primers PCR a úsáidtear don chéim qPCR in RT-qPCR a dhearadh chun acomhal exon-exon a chuimsiú, áit a bhféadfadh primer aimpliúcháin teorainn iarbhír exon-intron a thrasnú.Ós rud é nach bhfuil na seichimh DNA géanómacha intron aimplithe, laghdaíonn an dearadh seo an baol go mbeidh dearfacha bréagach méadaithe ó éilliú DNA géanómach.

Mura féidir primers a dhearadh chun teorainneacha exon nó exon-exon a scaradh, d'fhéadfadh go mbeadh gá le samplaí RNA a chóireáil le DNase I nó dsDNase saor ó RNase chun éilliú DNA géanómach a bhaint.

Rialú RT-qPCR

Ba cheart rialú diúltach trascríobh droim ar ais (-rialú RT) a áireamh i ngach turgnaimh RT-qPCR chun éilliú DNA a bhrath (cosúil le táirgí DNA genomic nó PCR ó imoibrithe roimhe seo).Tá gach comhpháirt imoibrithe sa rialú seo seachas transcriptase droim ar ais.Ós rud é nach dtarlaíonn trascríobh droim ar ais leis an rialú seo, má breathnaítear aimpliú PCR, is dóichí go bhfuil éilliú ó DNA.


Am postála: Lúnasa-02-2022