Ábhar tosaigh: RNA
Trascríobh droim ar ais cainníochtúil Is modh turgnamhach é PCR (RT-qPCR) a úsáidtear i dturgnaimh PCR ag baint úsáide as RNA mar ábhar tosaigh.Ar an modh seo, déantar RNA iomlán nó RNA teachtaire (mRNA) a thrascríobh ar dtús go DNA comhlántach (cDNA) trí transcriptase droim ar ais.Ina dhiaidh sin, rinneadh imoibriú qPCR ag baint úsáide as an cDNA mar theimpléad.Baineadh úsáid as RT-qPCR in éagsúlacht feidhmeanna bitheolaíochta móilíneacha, lena n-áirítear anailís léiriú géine, bailíochtú trasnaíochta RNA, bailíochtú microarray, braite pataigin, tástáil ghéiniteach, agus taighde galair.
Modhanna aon-chéim agus dhá chéim le haghaidh RT-qPCR
Is féidir RT-qPCR a bhaint amach trí mhodh aon-chéim nó dhá chéim.Comhcheanglaíonn RT-qPCR aon-chéim tras-scríobh droim ar ais agus aimpliú PCR, rud a ligeann do transcriptase droim ar ais agus DNA polymerase an t-imoibriú a chomhlánú sa fheadán céanna faoi na coinníollacha maolánacha céanna.Ní éilíonn RT-qPCR aon-chéim ach úsáid a bhaint as primers seicheamh-shonracha.I RT-qPCR dhá chéim, déantar tras-scríobh droim ar ais agus aimpliú PCR i dhá fheadán, ag baint úsáide as maoláin optamaithe éagsúla, coinníollacha imoibrithe, agus straitéisí dearadh primer.
Buntáiste | Míbhuntáiste | |
Céim a hAon | Tá níos lú earráide turgnamhacha ag an modh seo mar go ndéantar an dá imoibriú in aon fheadán amháin
Laghdaíonn níos lú céimeanna píopaithe an baol éillithe
Oiriúnach do aimpliú/scagadh ard-thréchuir, tapa agus in-atáirgthe | Ní féidir imoibrithe dhá chéim a bharrfheabhsú ar leithligh
Ós rud é go gcuirtear na coinníollacha imoibrithe i gcontúirt tríd an imoibriú dhá chéim a chomhcheangal, níl an íogaireacht chomh maith le híogaireacht an mhodha dhá chéim
Is beag an líon spriocanna a bhraitear le sampla amháin |
Dhá Chéim | Cumas leabharlanna cDNA cobhsaí a chruthú ar féidir iad a stóráil ar feadh tréimhsí fada ama agus a úsáid i bhfrithghníomhartha iolracha
Is féidir spriocghéinte agus géinte tagartha a mhéadú ón leabharlann cDNA chéanna gan gá le leabharlanna iolracha cDNA
Maoláin imoibrithe agus coinníollacha imoibrithe a chumasaíonn leas iomlán a bhaint as ritheann imoibrithe aonair
Roghnú solúbtha coinníollacha truicear | Trí fheadáin iolracha a úsáid, agus tuilleadh céimeanna píbéireachta méadaítear an baol éillithe DNA, agus Tógann am.
Éilíonn leas iomlán a bhaint níos mó ná an modh aon-chéim |
Táirgí gaolmhara:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Céim a hAon) -SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Céim a hAon) - Taqman
RT Easyᵀᴹ I Máistir Premix Do Shintéis CDNA Céad Snáithe
Fíor-ama PCR Easy-SYBR Green I Kit
Roghnú iomlán RNA agus mRNA
Agus turgnamh RT-qPCR á dhearadh, tá sé tábhachtach cinneadh a dhéanamh ar cheart RNA iomlán nó mRNA íonaithe a úsáid mar theimpléad le haghaidh trascríobh droim ar ais.Cé go bhféadfadh mRNA íogaireacht beagán níos airde a sholáthar, is minic a úsáidtear RNA iomlán fós.Is é an chúis atá leis seo ná go bhfuil buntáiste níos tábhachtaí ag RNA iomlán mar ábhar tosaigh ná mRNA.Ar dtús, éilíonn an próiseas níos lú céimeanna íonúcháin, rud a chinntíonn aisghabháil cainníochtúil níos fearr ar theimpléad agus normalú níos fearr ar thorthaí go dtí líon na gceall tosaigh.Ar an dara dul síos, seachnaíonn sé an chéim saibhrithe mRNA, rud a d’fhéadfadh torthaí sceabhacha a sheachaint mar gheall ar ghnóthachain éagsúla mRNAanna éagsúla.Ar an iomlán, ós rud é go bhfuil cainníochtú coibhneasta na sprice géine níos tábhachtaí i bhformhór na n-iarratas ná íogaireacht iomlán an bhrath, tá RNA iomlán níos oiriúnaí i bhformhór na gcásanna.
primer trascríobh droim ar ais
Sa mhodh dhá chéim, is féidir trí mhodhanna éagsúla a úsáid chun an t-imoibriú cDNA a phríomhú: primers oligo(dT), primers randamach, nó primers seicheamh-shonracha.Go tipiciúil, úsáidtear primers oligo(dT) agus primers randamach i dteannta a chéile.Cuireann na primers seo in aghaidh an tsnáithe teimpléid mRNA agus cuireann siad tras-traipiseas droim ar ais le pointe tosaigh don tsintéis.
Roghnú primer | Struchtúr agus feidhm | Buntáiste | Míbhuntáiste |
primer Oligo(dT) (nó primer oligo(dT) ar ancaire) | Annealing sínte chuig iarmhair tímín ag eireaball polai(A) mRNA;tá G, C, nó A ag an deireadh 3′ (láithreán ancaire) le primer ancaire oligo(dT) | Sintéis de cDNA lánfhad ó mRNA pola(A) eireaball
Infheidhme nuair a bhíonn níos lú ábhar tosaigh ar fáil
Cinntíonn suíomh ancaireachta go gceanglaíonn an primer oligo(dT) d'eireaball 5′ polai(A) an mRNA | Níl sé oiriúnach ach amháin chun géinte a aimpliú le heireabaill phola(A).
Faigh cDNA teasctha ón suíomh priming*2 i bpola(A)
Claonadh chun ceangal go dtí an deireadh 3′*
* Laghdaítear an fhéidearthacht seo má úsáidtear priméirí oligo(dT) ar ancaire |
primer randamach
| 6 go 9 bonn ar fad, ar féidir leo a anáil chuig láithreáin iolracha le linn trascríobh RNA | Anneal do gach RNA (tRNA, rRNA, agus mRNA)
Oiriúnach do thras-scríbhinní le struchtúr tánaisteach suntasach, nó nuair atá níos lú ábhar tosaigh ar fáil
Toradh cDNA ard | Déantar cDNA droim ar ais a thrascríobh ó gach RNA, rud nach mbíonn ag teastáil de ghnáth agus d'fhéadfadh sé comhartha an sprice mRNA a chaolú
cDNA teasctha a fháil |
primers seicheamh-shonracha | Bunúsanna saincheaptha a dhíríonn ar sheichimh shonracha mRNA | leabharlann cDNA ar leith
Feabhas a chur ar íogaireacht
Ag baint úsáide as primers qPCR droim ar ais | Níl sé teoranta ach amháin do shintéis sprice amháin |
Trascríobh droim ar ais
Is einsím é transcriptase droim ar ais a úsáideann RNA chun DNA a shintéisiú.Tá gníomhaíocht RNase ag roinnt transcriptases droim ar ais agus is féidir leo snáitheanna RNA a dhíghrádú i snáitheanna hibrideacha RNA-DNA tar éis trascríobh.Mura bhfuil gníomhaíocht einsímeach RNase aige, is féidir RNaseH a chur leis le haghaidh éifeachtacht qPCR níos airde.I measc na n-einsímí a úsáidtear go coitianta tá víreas leoicéime Moloney murine droim ar ais transcriptase agus myeloblastoma éanúil víreas droim ar ais transcriptase.Le haghaidh RT-qPCR, tá sé oiriúnach transcriptase droim ar ais a roghnú le teirmeastatacht níos airde, ionas gur féidir sintéis cDNA a dhéanamh ag teochtaí níos airde, ag cinntiú go n-áiritheofar trascríobh rathúil RNAanna le struchtúr tánaisteach níos airde, agus a ngníomhaíocht iomlán á gcoimeád ar fud an imoibrithe, rud a fhágann go bhfuil táirgeacht cDNA níos airde.
Táirgí gaolmhara:
Trascríobh Droim ar Ais Foreasy M-MLV
Gníomhaíocht RNase H de thrascríobh droim ar ais
Tá RNaseH in ann snáitheanna RNA a dhíghrádú ó dhúpléacsanna RNA-DNA, rud a ligeann do shintéis éifeachtach DNA dhá shnáithe.Mar sin féin, agus mRNA fada á úsáid mar theimpléad, féadfar an RNA a dhíghrádú roimh am, agus cDNA teasctha mar thoradh air.Dá bhrí sin, is minic a bhíonn sé tairbheach gníomhaíocht RNaseH a íoslaghdú le linn clónáil cDNA má theastaíonn sintéis tras-scríbhinní fada.I gcodarsnacht leis sin, is minic a bhíonn tras-scríbhinní droim ar ais le gníomhaíocht RNase H tairbheach d'iarratais qPCR toisc go bhfeabhsaíonn siad leá déphléacsanna RNA-DNA le linn an chéad timthriall de PCR.
Dearadh primer
Ba cheart go hidéalach go ndéanfaí na primers PCR a úsáidtear don chéim qPCR in RT-qPCR a dhearadh chun acomhal exon-exon a chuimsiú, áit a bhféadfadh primer aimpliúcháin teorainn iarbhír exon-intron a thrasnú.Ós rud é nach bhfuil na seichimh DNA géanómacha intron aimplithe, laghdaíonn an dearadh seo an baol go mbeidh dearfacha bréagach méadaithe ó éilliú DNA géanómach.
Mura féidir primers a dhearadh chun teorainneacha exon nó exon-exon a scaradh, d'fhéadfadh go mbeadh gá le samplaí RNA a chóireáil le DNase I nó dsDNase saor ó RNase chun éilliú DNA géanómach a bhaint.
Rialú RT-qPCR
Ba cheart rialú diúltach trascríobh droim ar ais (-rialú RT) a áireamh i ngach turgnaimh RT-qPCR chun éilliú DNA a bhrath (cosúil le táirgí DNA genomic nó PCR ó imoibrithe roimhe seo).Tá gach comhpháirt imoibrithe sa rialú seo seachas transcriptase droim ar ais.Ós rud é nach dtarlaíonn trascríobh droim ar ais leis an rialú seo, má breathnaítear aimpliú PCR, is dóichí go bhfuil éilliú ó DNA.
Am postála: Lúnasa-02-2022