Forbhreathnú
Sainaithint tapa ar phlandaí trasgenacha
Téacs/Tong Yucheng
Oibríocht thurgnamhach/Han Ying
Eagarthóir/Wen Youjun
Focail/1600+
Am léitheoireachta molta/8-10 nóiméad
Sainaithint tapa ar phlandaí trasgenacha
Mar núíosach sa tsaotharlann, ní post maith é plandaí dearfacha a scagadh amach as roinnt plandaí a bhfuil ráta comhshó íseal acu.Ar an gcéad dul síos, ní mór DNA a bhaint as líon mór samplaí ceann ar cheann, agus ansin déanfar na géinte coigríche a bhrath trí PCR.Mar sin féin, is minic a bhíonn bearnaí agus bannaí sna torthaí le roinnt míreanna ó am go chéile, ach ní féidir a chinneadh an bhfuil braite caillte nó braite bréagach..An bhfuil sé thar a bheith cabhrach tabhairt faoi phróiseas agus torthaí turgnamhacha den sórt sin?Ná bí buartha, múineann deartháir duit conas plandaí deimhneacha trasghéineacha a scagadh amach go héasca agus go cruinn.
Céim 1: Dearadh primers braite
Déan géine endogenous agus géine exogenous a bhrath de réir an tsampla atá le tástáil, agus roghnaigh seicheamh ionadaíoch 100-500bp sa ghéine le haghaidh dearadh primer.Is féidir le primers maith cruinneas na dtorthaí braite a chinntiú agus an t-am braite a ghiorrú (féach an t-aguisín le haghaidh primers braite a úsáidtear go coitianta).
Nóta:
Ní mór do na primers nua-dheartha na coinníollacha imoibrithe a bharrfheabhsú agus cruinneas, cruinneas agus teorainn braite an bhrath a fhíorú sula ndéantar brath ar scála mór.
Céim 2:Prótacal turgnamhach a fhorbairt
Rialú dearfach: Bain úsáid as an DNA íonaithe ina bhfuil an spriocbhlúire mar theimpléad chun a chinneadh an bhfuil an córas imoibrithe PCR agus na coinníollacha gnáth.
Rialú diúltach/bán: Úsáid teimpléad DNA nó ddH2O nach bhfuil an spriocbhlúire ann mar theimpléad chun a bhrath an bhfuil foinse éillithe sa chóras PCR.
Rialú tagartha inmheánach: bain úsáid as an meascán primer/probe de ghéin inghineach an tsampla atá le tástáil chun a mheas an féidir an teimpléad a bhrath trí PCR.
Nóta:
Ba cheart rialuithe dearfacha, diúltacha/geala agus rialuithe inmheánacha rialaithe a shocrú le haghaidh gach tástála chun bailíocht thorthaí an turgnaimh a mheas.
Céim 3: Ullmhúchán turgnaimh
Roimh úsáid, tabhair faoi deara an bhfuil an réiteach measctha go cothrom.Má aimsítear deascadh, is gá é a thuaslagadh agus a mheascadh de réir na dtreoracha roimh úsáid.Ní mór meascán 2 × PCR a phíobáil agus a mheascadh arís agus arís eile le micreaipéad sula n-úsáidtear é chun dáileadh ian míchothrom a sheachaint.
Nóta:
Tóg amach na treoracha agus léigh go cúramach iad, agus ullmhóidí a dhéanamh roimh an turgnamh i gcomhréir dhlúth leis na treoracha.
Céim 4: Córas imoibrithe PCR a ullmhú
De réir an phrótacail thurgnamhaigh, measc na primers, H2O, 2 × PCR meascán, lártheifneoir agus iad a dháileadh ar gach feadán imoibriúcháin.
Nóta:
Le haghaidh tástála ar scála mór nó fadtéarmach, moltar córas imoibrithe PCR a úsáid ina bhfuil einsím UNG, a fhéadfaidh éilliú aerasóil de bharr táirgí PCR a sheachaint go héifeachtach.
Céim 5: Cuir teimpléad imoibrithe leis
Ag baint úsáide as teicneolaíocht Direct PCR, níl aon ghá le próiseas íonú aigéad núicléach tedious.Is féidir an teimpléad samplach a ullmhú laistigh de 10 nóiméad agus a chur leis an gcóras imoibrithe PCR comhfhreagrach.
Nóta:
Tá éifeacht braite níos fearr ag an modh Lysis, agus is féidir an táirge a fhaightear a úsáid le haghaidh imoibrithe braite iolracha.
5.1: PCR díreach na duilleoga
De réir mhéid an phictiúr sa lámhleabhar, gearrtha an fíochán duille le trastomhas 2-3mm agus é a chur sa chóras imoibrithe PCR.
Nóta: Cinntigh go bhfuil na blúirí duille tumtha go hiomlán sa réiteach imoibrithe PCR, agus nach gcuireann siad fíochán duille iomarcach.
5.2: Modh lysis duille
Gearr an fíochán duille le trastomhas 5-7mm agus cuir i bhfeadán lártheifneoir é.Má roghnaíonn tú duilleoga aibí, le do thoil a sheachaint ag baint úsáide as na fíocháin príomh-vein an duilleog.Pípéad 50ul Maolán P1 a lísate isteach i bhfeadán lártheifneoir chun a chinntiú gur féidir leis an lysate an fíochán duille a thumadh go hiomlán, é a chur i dtimthriallta teirmeach nó folctha miotail, agus lyse ag 95 ° C ar feadh 5-10 nóiméad.
Cuir réiteach neodraithe 50ul Maolán P2 leis agus measc go maith.Is féidir an lysate mar thoradh air a úsáid mar theimpléad agus a chur leis an gcóras imoibrithe PCR.
Nóta: Ba cheart go mbeadh an méid teimpléad idir 5-10% den chóras PCR, agus níor chóir go mbeadh níos mó ná 20% (mar shampla, i gcóras PCR 20μl, cuir 1-2μl de mhaolán lysis, nach mó ná 4μl).
Céim 6: Frithghníomh PCR
Tar éis an feadán imoibrithe PCR a lártheifneoiriú, cuir iad in ionstraim PCR le haghaidh aimplithe.
Nóta:
Úsáideann an t-imoibriú teimpléad neamh-íonaithe le haghaidh aimplithe, mar sin tá líon na dtimthriallta aimpliúcháin 5-10 timthriall níos mó ná nuair a úsáidtear teimpléad DNA íonaithe.
Céim 7: Leictreafóiréis a bhrath agus anailís a dhéanamh ar thorthaí
M: 100bp Dréimire DNA
1\4: Modh DNA íonaithe
2\5: Modh PCR díreach
3\6: Rialú bán
Rialú Cáilíochta:
Ba cheart go gcomhlíonfadh torthaí tástála na rialuithe éagsúla a leagtar síos sa turgnamh na coinníollacha seo a leanas.Seachas sin, ba cheart cúis na faidhbe a anailísiú, agus ba cheart an tástáil a dhéanamh arís tar éis deireadh a chur leis an bhfadhb.
Tábla 1. Gnáththorthaí tástála grúpaí rialaithe éagsúla
*Nuair a úsáidtear an plasmid mar rialú dearfach, is féidir leis an toradh tástála géine ingenous a bheith diúltach
Breithiúnas ar thorthaí:
A. Tá toradh tástála géine endogenous an tsampla diúltach, rud a thugann le fios nach féidir an DNA atá oiriúnach do ghnáthbhrath PCR a bhaint as an sampla nó go bhfuil coscairí imoibrithe PCR sa DNA asbhainte, agus ba cheart an DNA a bhaint arís.
B. Tá toradh tástála géine endogenous an tsampla dearfach, agus tá toradh tástála na géine exogenous diúltach, rud a léiríonn go mbaintear an DNA atá oiriúnach do ghnáthbhrath PCR as an sampla, agus is féidir a mheas nach bhfuil an géine XXX braite sa sampla.
C. Tá toradh tástála géine endogenous an tsampla dearfach, agus tá toradh tástála na géine exogenous dearfach, rud a léiríonn go bhfuil an DNA atá oiriúnach do ghnáthbhrath PCR bainte as an sampla, agus tá géine XXX sa DNA samplach.Is féidir tuilleadh turgnaimh deimhnithe a dhéanamh.
Céim 8: Dearadh primers braite
Tar éis an turgnaimh, bain úsáid as tuaslagán fochlóiríte sóidiam 2% agus tuaslagán eatánóil 70% chun an limistéar turgnamhach a scriosadh chun truailliú comhshaoil a chosc.
Aguisín
Tábla 2. Na primers a úsáidtear go coitianta chun PCR a bhrath go ginearálta ar phlandaí géinmhodhnaithe
Doiciméad tagartha:
SN/T 1202-2010, Modh braite PCR cáilíochtúil do chomhábhair phlandaí géinmhodhnaithe i mbia.
Fógra ón Aireacht Talmhaíochta 1485-5-2010, Tástáil na gcomhábhar de phlandaí géinmhodhnaithe agus a gcuid táirgí-rís M12 agus a díorthaigh.
Am postála: Meitheamh-09-2021
