Is galar ionfhabhtaíoch é COVID-19 de bharr Siondróm Trom Riospráide Géar-Chineál Coronavirus 2. Nuair a bhíonn duine ionfhabhtaithe, áirítear ar na hairíonna is coitianta fiabhras, casacht, agus giorracht anála.

Is féidir na samplaí a úsáidtear le haghaidh tástála a bhailiú le táithíní nasopharyngeal nó táithíní oropharyngeal.

Cad é PCR?

Is é an modh caighdeánach braite coronavirus ná imoibriú slabhra polymerase, PCR.Is modh é seo a úsáidtear go forleathan i mbitheolaíocht mhóilíneach.Is féidir leis na milliúin a chóipeáil go tapa ar na billiúin blúirí DNA ar leith.

Tá géanóm RNA aon-shnáithe an-fhada sa choróinvíreas nua.Chun na víris seo a bhrath trí PCR, ní mór móilíní RNA a thiontú ina seichimh DNA comhlántacha trí transcriptase droim ar ais, agus ansin is féidir an DNA nua-shintéisithe a mhéadú trí nósanna imeachta caighdeánacha PCR, ar a dtugtar go coitianta RT-PCR.

Próiseas RT-PCR

eastóscadh RNA

Chun an modh seo a dhéanamh, ba cheart RNA víreasach a bhaint as go bunúsach.Is féidir éagsúlacht feisteáin íonúcháin RNA a úsáid le haghaidh scaradh áisiúil, tapa agus éifeachtach.

Chun RNA víreasach a bhaint as trealamh tráchtála, cuir an sampla le feadán micrealártheifneoir ar dtús agus ansin é a mheascadh leis an maolán lysis.Tá an-dínádúrú ar an maolán seo agus is gnách go mbíonn iseatiocianáit feanól agus guainidín ann.Ina theannta sin, is gnách go mbíonn coscairí RNase i láthair sa mhaolán lysis chun leithlisiú RNA víreasach slán a chinntiú.

Tar éis an maolán lysis a chur leis, vortex an feadán measctha trí chuisle agus gor ag teocht an tseomra.Déantar an víreas a liostáil ansin faoi choinníollacha an-dínádúraithe arna soláthar ag an maolán lysis.

Tar éis an sampla a lysed, úsáidtear feadán lártheifneoir don nós imeachta íonú.Déantar an sampla a luchtú isteach sa fheadán lártheifneoir agus ansin lártheifneoiriú.

Is modh eastósctha céim soladach é an nós imeachta seo ina bhfuil an chéim stadach comhdhéanta de mhaitrís glóthach shilice.

Faoi choinníollacha barrmhaithe salainn agus pH, ceanglaíonn móilíní RNA leis an scannán shilice.

Ag an am céanna, baintear próitéin agus ábhar salaithe eile.

Tar éis lártheifneora, cuir an feadán lártheifneoir isteach i bhfeadán bailithe glan, caith an scagáit amach, agus ansin cuir maolán níocháin leis.

Cuir an feadán sa lártheifneoir arís chun an maolán níocháin a bhrú tríd an scannán.Bainfidh sé seo na neamhíonachtaí go léir atá fágtha ón scannán, ag fágáil ach an RNA ceangailte leis an glóthach shilice.

Tar éis an sampla a nite, cuir an feadán isteach i bhfeadán glan microcentrifuge agus cuir an maolán elution leis.

Déantar é a lártheifneoiriú ansin chun an maolán elution a bhrú tríd an scannán.Baineann an maolán elution RNA víreasach as an gcolún casadh agus faigheann sé RNA íonaithe saor ó phróitéiní, coscairí agus ábhar salaithe eile.

CÉIM 2

Tiúchan measctha

Tar éis an RNA víreasach a bhaint, is é an chéad chéim eile ná an meascán imoibrithe a ullmhú le haghaidh aimpliú PCR.Sa chéim seo, úsáidtear díriú.Is tuaslagán tiubhaithe réamh-mheasctha é an tuaslagán tiubhaithe seo comhdhéanta de réamh-mheascán, tras-scríbhinn aisiompaithe, núicléatídí, primer tosaigh, primer droim ar ais, taiscéalaí TaqMan agus DNA polymerase.

Ar deireadh, chun an meascán imoibrithe seo a chomhlánú, cuirtear an teimpléad RNA leis.Déantar na feadáin a mheascadh le vortexing pulse, agus ansin déantar an meascán imoibrithe a luchtú isteach sa phláta PCR.De ghnáth bíonn 96 toibreacha sa phláta PCR agus féadann sé samplaí iolracha a anailísiú ag an am céanna.

CÉIM 3

aimpliú PCR

Ansin, cuir an pláta sa mheaisín PCR, ar timthriall teirmeach é go bunúsach.

Úsáidtear RT-PCR fíor-ama chun an coronavirus nua 2019 a bhrath tríd an seicheamh sprice sa ghéine RdrRP, géine E agus N a mhéadú.Braitheann rogha na sprice géine ar an seicheamh primer agus probe.

Is é an chéad chéim de RT-PCR trascríobh droim ar ais.Déantar an chéad sraith de DNA comhlántach a shintéisiú, a thionscnaíonn an primer droim ar ais PCR, a cheanglaíonn an chuid chomhlántach den genome RNA víreasach.Ansin cuireann transcriptase droim ar ais núicléatídí DNA go dtí an 3′deireadh an primer chun DNA comhlántach leis an RNA víreasach a shintéisiú.Braitheann teocht agus fad na céime seo ar na primers, an sprioc-RNA, agus an tras-scríbhinní droim ar ais a úsáidtear.

Ansin, cuirtear céim tosaigh dínádúraithe i bhfeidhm, rud a fhágann dínádúrú na hibrideach RNA-DNA.Tá an chéim seo riachtanach chun an DNA polymerase a ghníomhachtú.Ag an am céanna, tá transcriptase droim ar ais díghníomhaithe.

Is éard atá i PCR ná sraith de thimthriallta teirmeacha.Tá céimeanna dínádúraithe, annealaithe agus síneadh i ngach timthriall.

Is éard atá i gceist leis an gcéim dínádúraithe ná an seomra imoibrithe a théamh go 95 céim Celsius agus é a úsáid chun an teimpléad DNA dhá shnáithe a dhínádúrú.

Sa chéad chéim eile, laghdaítear an teocht imoibrithe go 58 céim Celsius, rud a ligeann don primer tosaigh an chuid chomhlántach dá theimpléad DNA aon-shnáithe a anneal.Braitheann an teocht annealing go díreach ar fhad agus comhdhéanamh an primer.

Sa chéim síneadh, sintéisíonn an DNA polymerase snáithe DNA nua atá comhlántach leis an snáithe teimpléad DNA.Trí núicléis shaora atá comhlántach leis an teimpléad sa treo 5′ go 3′ ón meascán imoibriúcháin a chur leis.Braitheann teocht na céime seo ar an DNA polymerase a úsáidtear.

Tar éis an chéad timthriall, faightear sprioc DNA dhá shraith.

Ansin, cuir isteach an dara timthriall.Déantar an DNA dúbailte-shnáithe a dhínádúrú chun dhá mhóilín DNA aon-shnáithe a tháirgeadh.

Sa chéad chéim eile, íslítear an teocht imoibrithe, cuirtear na primers annealaithe chuig gach teimpléad DNA aon-shnáithe, agus cuirtear an taiscéalaí Taq-man annealaithe go dtí an chuid chomhlántach den sprioc-DNA.

Is éard atá sa taiscéalaí TaqMan ná fluarafór atá nasctha go comhfhiúsach le foirceann 5′ an tóireadóir oligonucleotide.Nuair a bhíonn foinse solais an rothaire sceitimíní air, astaíonn an fluarafór fluaraiseacht.Ina theannta sin, tá an taiscéalaí comhdhéanta de quencher ag an 3′deireadh.Coisceann géine an tuairisceora don mhúchadh an fhluaraiseacht a bhrath.

Sa chéim síneadh, sintéisíonn an DNA polymerase snáithe nua.Nuair a shroicheann an pholaiméiráis an tóireadóir TaqMan, scoilteann a ghníomhaíocht núicléas 5′ in-inghineach an taiscéalaí, ag scaradh an dath ón múchadh.

Le gach timthriall de PCR, scaoiltear níos mó móilíní ruaime, rud a fhágann go dtiocfaidh méadú ar dhéine fluaraiseachta i gcomhréir le líon na n-amplicons sintéiseithe.

Ligeann an modh seo meastachán a dhéanamh ar líon seicheamh tugtha atá i láthair sa sampla.Déantar líon na blúirí DNA le snáitheanna dúbailte a dhúbailt i ngach timthriall.Mar sin, is féidir PCR a úsáid chun anailís a dhéanamh ar shamplaí an-bheag.

Le haghaidh comhartha fluaraiseacha a thomhas, lampa halaigine tungstain, scagaire excitation, frithchaiteoir, lionsa, scagaire astaíochta agus gléas cúpláilte úsáid ceamara CCD.

CÉIM 4 Braith

Le haghaidh comhartha fluaraiseacha a thomhas, lampa halaigine tungstain, scagaire excitation, frithchaiteoir, lionsa, scagaire astaíochta agus gléas cúpláilte úsáid ceamara CCD.

Tá an solas scagtha ón lampa léirithe ag an bhfrithchaiteoir, téann sé tríd an lionsa comhdhlúthadáin, agus tá sé dírithe go lár gach poll.Ansin léirítear an fhluaraiseacht a astaítear as an bpoll ón scáthán, téann sé tríd an scagaire astaíochta, agus aimsíonn ceamara CCD é.I ngach timthriall PCR, is féidir leis an CCD an solas fluorophore féin-excited a bhrath.

Tiontaíonn sé an solas gafa go sonraí digiteacha.Tugtar PCR fíor-ama ar an modh seo, agus ceadaíonn sé monatóireacht fíor-ama ar dhul chun cinn an imoibrithe PCR.