1. Braith ionsúiteacht tuaslagáin RNA
Léiríonn ionsú ag 280, 320, 230, agus 260 nm luachanna aigéid núicléacha, cúlra (moirtiúlacht réitigh), tiúchan salainn, agus ábhar orgánach cosúil le próitéin, faoi seach.Go ginearálta féach ar OD260/OD280 (Cóimheas, R).Nuair a bhíonn 1.8 ~ 2.0 ann, is dóigh linn gur féidir glacadh le héilliú próitéine nó ábhar orgánach eile in RNA, ach ba chóir a thabhairt faoi deara nuair a úsáidtear Tris mar mhaolán chun an t-ionsúcht a bhrath, féadfaidh an luach R a bheith níos mó ná 2 (go ginearálta ba chóir go mbeadh sé <2.2).Nuair a bhíonn R <1.8, tá truailliú próitéine nó ábhar orgánach eile sa réiteach níos soiléire, agus is féidir cinniúint an RNA a chinneadh de réir na riachtanas.Nuair a bhíonn R>2.2, ciallaíonn sé go bhfuil RNA hidrealú ina aigéad núicléasach amháin.
Patrún 2.Electrophoretic de RNA
Go ginearálta, úsáidtear glóthach dínádúraithe le haghaidh leictreafóiréis RNA, ach mura bhfuil sé ach chun cáilíocht RNA a bhrath, ní gá glóthach dínádúraithe, agus is féidir glóthach agarose gnáth a úsáid.Is é cuspóir an leictreafóiréis ná sláine bannaí 28S agus 18S agus a gcóimheas, nó sláine smearaidh mRNA a bhrath.Go ginearálta, má tá na bannaí 28S agus 18S geal, soiléir, agus géar (ag tagairt d'imill na mbannaí atá soiléir), agus go bhfuil gile 28S níos mó ná dhá uair níos mó ná an banna 18S, measaimid go bhfuil cáilíocht an RNA go maith.
Is iad seo thuas an dá mhodh a úsáideann muid go coitianta, ach ní féidir le ceachtar den dá mhodh seo a insint go soiléir dúinn an bhfuil RNase iarmharach sa réiteach RNA.Má tá méid an-bheag RNase sa réiteach, tá sé deacair dúinn é a bhrath leis an modh thuas, ach déantar an chuid is mó de na frithghníomhartha einsímeacha ina dhiaidh sin ag os cionn 37 céim agus ar feadh i bhfad.Ar an mbealach seo, má tá méid an-bheag RNase sa réiteach RNA, ansin beidh timpeallacht agus am an-oiriúnach chun a ról a imirt sna turgnaimh ina dhiaidh sin, agus ar ndóigh beidh an turgnamh fuar ag an am seo.Anseo thíos tugtar isteach modh a fhéadfaidh a dhearbhú an bhfuil RNase iarmharach sa réiteach RNA.
3. Tástáil caomhnaithe teasa
De réir an tiúchan sampla, tarraing dhá RNA 1000 ng RNA ón réiteach RNA agus cuir le feadán lártheifneoir 0.5 ml é, agus é a fhorlíonadh le maolán pH 7.0 Tris go dtí toirt iomlán de 10 ul, agus ansin caipín an fheadáin a shéaladh.Cuir ceann acu i ndabhach uisce teocht tairiseach ag 70 ° C agus é a choinneáil te ar feadh 1 u.Stóráladh an chuid eile i gcuisneoir -20 ° C ar feadh 1 h.Nuair a bhíonn an t-am istigh, bain an dá shampla le haghaidh leictreafóiréis.Tar éis don leictreafóiréis a bheith críochnaithe, déan comparáid idir na bannaí leictreafóiréiseacha den dá cheann.Má tá bannaí an dá cheann comhsheasmhach nó nach bhfuil aon difríocht shuntasach acu (ar ndóigh, comhlíonann a gcuid bannaí na coinníollacha i modh 2 freisin), ciallaíonn sé nach bhfuil aon éilliú RNase iarmharach sa réiteach RNA, agus tá cáilíocht an RNA an-mhaith.Os a choinne sin, má léiríonn an sampla gortha ag 70°C díghrádú soiléir, léiríonn sé go bhfuil éilliú RNase sa tuaslagán RNA.
2 Modhanna agus teicnící turgnamhacha le haghaidh eastóscadh RNA
Is iad na fadhbanna a bhíonn againn go minic agus RNA á bhaint as: (1) Tá toradh RNA íseal;(2) Tá truailliú salann tromchúiseach ag RNA;(3) Tá truailliú tuaslagóir orgánach tromchúiseach ag RNA;(4) díghrádú samplach agus fadhbanna eile
1. Imoibrithe eastóscadh RNA iomlán a úsáidtear go coitianta
Is é an modh guanidine isothiocyanate agus an modh Trizol na modhanna is coitianta a úsáidtear chun RNA iomlán a bhaint as fíocháin ainmhithe agus cealla ainmhithe.Tá sé oiriúnach go háirithe do shamplaí beaga agus fíocháin atá deacair go háirithe a bhaint as, mar shampla RNA iomlán a bhaint as craiceann coinín agus fíochán nascach ainmhithe;ina theannta sin, is féidir Trizol, mar imoibrí lysis ginearálta, a úsáid freisin chun fíocháin plandaí, baictéir, fungais agus fíocháin eile a eastóscadh.Maidir le fíocháin plandaí ina bhfuil polaisiúicrídí agus polyphenols, mar shampla camellia oleifera, duilleoga tae, ráibe, etc., is féidir modh CTAB a úsáid freisin chun RNA iomlán a bhaint as.
Mar mhodh traidisiúnta, tá an-tóir ar an modh colún dúbailte freisin mar gheall ar a ghnáthoibriú teochta, ní gá RNase a chur leis, agus sábháilteacht - gan clóraform, feanóil agus imoibrithe orgánacha eile le haghaidh eastóscadh.(táirgí molta )
2. Eastóscadh RNA iomlán ó fhíocháin ainmhithe
(1) Déan iarracht fíochán úr a roghnú, mura bhfuil sé úr (b'fhearr laistigh de thrí mhí - 80 ℃ cuisneoir nó reoite i nítrigine leachtach. Nuair a bhíonn tú ag gearradh fíocháin, ná gearrtha go díreach ag teocht an tseomra, bí cinnte go gcuirfí ar an mbosca oighir é, déan iarracht reo agus leá arís agus arís eile a sheachaint.
(2) Bain úsáid as siosúr glan agus tweezers chun píosa beag fíocháin a ghearradh, déan iarracht an chuid lárnach den fhíochán a ghearradh nuair a bhíonn an sampla á ghearradh, nó an píosa mór fíocháin a ghearradh ar dtús ón lár, agus ansin an sampla a ghearradh ag an suíomh incision úr.Ba chóir an fíochán a bhaintear a shredded go hiomlán, cuir an fíochán shredded isteach i bhfeadán EP gan RNase, cuir an lysate, ba chóir an fíochán shredded a bheith faoi lé go hiomlán ar an lysate, agus a ullmhú le haghaidh homogenization.
(3) Le haghaidh gnáth-fhíocháin, roghnaigh fíocháin bean-mhéid mung (30-60 mg) le haghaidh homogenization.Má tá cuid mhór próitéine, saille, nó fíocháin dlúth neamhshnáithíneacha mar ae sna fíocháin, méadóidh nó laghdaigh méid na bhfíochán gearrtha go cuí (roghnach) Roghnaigh 10~20 mg).
(4) Má bhaintear muscle éisc, feoil ribí róibéis, smugairle róin agus fíocháin eile le hábhar ard uisce, ba cheart an méid sampla a mhéadú go cuí (moltar 100-200 mg).
(5) Má cheadaíonn coinníollacha, is féidir an fíochán ainmhithe a bhaint go díreach tar éis a bheith homogenized le homogenizer fíocháin ard-pas, mura bhfuil aon trealamh den sórt sin ann.
(6) Ní mór an RNA a fhaightear tar éis an eastóscadh deiridh a chur ar an mbosca oighir láithreach chun díghrádú RNA a laghdú.
3. Eastóscadh RNA cille ainmhithe
(1) Cealla fionraí: lártheifneoir go díreach agus caith an meán, nigh le PBS steiriúla ar feadh 1-2 uair, ansin fionraí le méid cuí PBS, agus ansin cuir lysate le haghaidh lysis.Ná cuir an lysate go díreach chuig na cealla deasctha tar éis an leacht a chaitheamh amach go hiomlán.Cuirfidh sé seo faoi deara go mbeidh an pacáiste histone a scaoiltear tar éis na cealla lysed ar an gciseal seachtrach cloí leis an taobh amuigh de na cealla deasctha, rud a chuirfidh teorainn le teagmháil na gcealla taobh istigh den millíní leis an lysate., a eascraíonn i lysis cille neamhiomlán agus toradh RNA laghdaithe.
(2) Cealla leath-ghreamaitheacha nó nach bhfuil cloí go docht: Tar éis an meán a chaitheamh amach, nigh le PBS ar feadh 1-2 uair, ansin ionsú go díreach méid cuí PBS agus buille an mhias cultúir le pípéad nó gunna chun na cealla a shéideadh, agus iad a aistriú chuig cealla saor ó RNA.Cuir an lysate le feadán EP na heinsíme lena eastóscadh.
(3) Cealla greamaitheacha: ní mór iad a dhíleá le trypsin ar dtús, ansin iad a bhailiú isteach i bhfeadáin EP saor ó RNase, a lártheifneoiriú chun an snámhán a bhaint, a nite 1-2 huaire le PBS chun breis trypsin a bhaint, agus a chur ar fionraí arís le méid cuí PBS Ansin téigh ar aghaidh go dtí an chéim eastósctha.
4. Eastóscadh RNA plandaí
Tá fíocháin plandaí saibhir i gcomhdhúile feanólacha, nó saibhir i polaisiúicrídí, nó tá roinnt meitibilítí tánaisteacha neamhaitheanta acu, nó tá ardghníomhaíocht RNase acu.Déantar na substaintí seo a chomhcheangal go dlúth le RNA tar éis lysis cille chun coimpléisc dothuaslagtha nó deascáin cholóideach a fhoirmiú, atá deacair a bhaint.Dá bhrí sin, nuair a bhaintear fíochán plandaí amach, ní mór dúinn trealamh a roghnú do phlandaí.Is féidir leis an lysate sa trealamh a réiteach go héifeachtach na fadhbanna a bhaineann le ocsaídiú éasca polyphenols agus scaradh comhdhúile polaisiúicríde agus aigéid núicléacha.
(Le haghaidh eastóscadh RNA planda polyphenol polaisiúicríd, táirgí molta:
(1) Ba chóir craiceann, laíon, síolta, duilleoga, etc. den phlanda a bheith meilte go hiomlán i moirtéal.Le linn an phróisis mheilt, ba cheart nítrigine leachtach a athlánú in am chun an sampla a leá a sheachaint.Ba cheart an sampla talún a chur leis an lysate go tapa agus é a chroitheadh chun díghrádú RNA a sheachaint.
(2) I gcás samplaí saibhir i snáithín cosúil le rís agus duilleoga cruithneachta, ba cheart an méid eastóscadh a laghdú go cuí, ar shlí eile ní bheidh an meilt fíocháin agus an lysis iomlán, rud a fhágann go mbeidh toradh íseal de RNA eastósctha.
(3) Maidir le fíocháin plandaí le hábhar ard uisce, mar shampla torthaí pomegranate, torthaí watermelon, torthaí peach, etc., ba cheart méid an tsampla a mhéadú go cuí (tá 100-200 mg roghnach).
(4) Moltar go ginearálta fíocháin plandaí, mar shampla duilleoga plandaí, riosóim, torthaí crua agus ábhair eile, nítrigin leachtach a úsáid chun na comhábhair a chur i moirtéal go críochnúil, agus ansin dul ar aghaidh go dtí an chéim eastósctha.Ní fhéadfaidh homogenizers fíocháin traidisiúnta a bheith éifeachtach chun fíocháin plandaí a homogenizing, agus go ginearálta ní mholtar iad.
5. Réamhchúraimí le haghaidh eastóscadh RNA
(1) Ba cheart go mbeadh samplaí fíocháin chomh úr agus is féidir chun reo agus leá arís agus arís eile a sheachaint.
(2) Ba chóir go mbeadh an fíochán talún go hiomlán le linn eastóscadh, agus níor chóir go mbeadh an méid fíocháin ró-bheag, gan trácht ar an iomarca.
(3) Ba cheart dóthain ama goir a thabhairt tar éis an lysate a chur leis chun an sampla a lyse go hiomlán.
(4) Nuair a úsáidtear an modh Trizol le haghaidh eastóscadh, is é an prionsabal ionsú an supernatant tar éis srathaithe "is fearr a ionanálú níos lú ná ionanálú níos mó", agus ní mór a bhaint as an ciseal lár, ar shlí eile beidh sé ina chúis le héilliú DNA genomic tromchúiseach.
(5) Nuair a bhíonn sé ag níochán, ba chóir go n-insíothlódh an leacht níocháin go hiomlán timpeall bhalla an fheadáin chun níocháin críochnúil a chinntiú.
(6) Maidir leis an modh eastósctha colún, chomh maith leis an gcolún a dhícheangal tar éis níocháin, ba cheart an colún asaithe a chur ar bhinse ultra-ghlan agus séidte ar feadh 5-10 nóiméad chun an tuaslagóir orgánach a ghalú go hiomlán go triomacht.
(7) Ag an elution deireanach den mhodh colún, tar éis uisce DEPC a chur leis, ba chóir é a ghoradh ar feadh 3-5 nóiméad, nó ba chóir an t-uisce DEPC a théamh go 60 ° C roimh ré chun an toradh elution a mhéadú.Sa mhodh deascadh traidisiúnta trizol agus isopropanol, déantar an RNA deiridh a thuaslagadh in uisce DEPC, mar sin ba cheart am cuí a thabhairt le haghaidh díscaoileadh, agus ba chóir bun an fheadáin lártheifneora a shéideadh go leanúnach le tip pípéad.
3 Three Cúiseanna agus réitigh do thiúchan íseal RNA/droch-chaighdeán
1. Tá an toradh ró-íseal
Tá an sampla a bhaintear ró-íseal, níl an méid iomlán leordhóthanach, nó tá an sampla a bhaintear ró-iomarca agus níl an lysis iomlán;ba cheart an fíochán nó na cealla de cháilíocht chuí a úsáid le haghaidh eastóscadh, ní mór réamhchóireáil an tsampla a dhéanamh go maith, agus ba cheart go mbeadh an lysis leordhóthanach.
2. Iarmhair genome
Nuair a bhaintear as modh Trizol, nuair a sucked an supernatant isteach sa lárchiseal tar éis an ciseal, beidh éilliú genome tromchúiseach a chur faoi deara;ba chóir cúram breise a ghlacadh agus tú ag leagan sraitheanna chun sucking isteach sa chiseal lár a sheachaint.Má úsáidtear an modh colún le haghaidh eastóscadh, is féidir trealamh ina bhfuil DNase I a roghnú le haghaidh eastóscadh.Déantar an t-aigéad núicléach atá asaithe ar an scannán a dhíleá go díreach le DNase I, rud a fhéadfaidh iarmhair DNA a laghdú go mór.
3. Díghrádú RNA
D'fhéadfadh sé gurb é díghrádú an tsampla eastósctha féin é, nó an díghrádú a tharla le linn an phróisis eastósctha;chomh fada agus is féidir, ba cheart samplaí úra a úsáid le haghaidh eastóscadh RNA, agus ba cheart na samplaí bailithe a stóráil i gcuisneoir nítrigine leachtach nó -80 ° C in am, agus ba cheart reo agus leá arís agus arís eile a sheachaint.Ba cheart leideanna saor ó RNase/DNase, feadáin lártheifneora agus ábhair eile a úsáid sa phróiseas eastósctha RNA.Ba cheart go mbeadh an próiseas eastósctha chomh tapa agus is féidir.Ba chóir an RNA a bhaintear a chur ar bhosca oighir agus a stóráil ag -80 in am.Más gá an RNA eastósctha a bhrath le leictreafóiréis glóthach, ba cheart leictreafóiréis a dhéanamh díreach tar éis eastóscadh, agus ba cheart ceann nua-ullmhaithe a chur in ionad an maolán leictreafóiréis.
4. Iarmhair salainn agus tuaslagóirí orgánacha
Tá salainn feanól agus guanidine sna himoibrithe eastóscadh, agus tá eatánól sa tuaslagán níocháin.Le linn an phróisis eastósctha, níor ghlac an lysate go hiomlán agus a dhiúscairt, agus níor triomaíodh an réiteach níocháin go hiomlán.Tá salainn iarmharacha agus tuaslagóirí orgánacha díobhálach do thrascríobh droim ar ais agus PCR ina dhiaidh sin.Céimeanna éagsúla cosc, mar sin ba chóir an lysate fíocháin a bhaint go hiomlán le linn an phróisis eastósctha, agus ba chóir go mbeadh an níocháin leordhóthanach ionas gur féidir ballaí an fheadáin máguaird a nite.Ina theannta sin, is céim riachtanach é an feadán a fholmhú agus a shéideadh, rud a laghdóidh an t-iarmhar ábhar orgánach a thuilleadh.
Chun tuilleadh eolais a fháil faoi eastóscadh RNA, lean ár suíomh Gréasáin le do thoil:
www.foreivd.com le haghaidh tuilleadh eolais.
Am postála: Dec-01-2022
